盛艷旻,張正方,王 珊,朱 勍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州310014)

環(huán)氧化物水解酶產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件的研究

盛艷旻,張正方,王 珊,朱 勍＊

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江杭州310014)

以鄰甲氧基苯基縮水甘油醚為唯一碳源,從土壤中篩選具有立體選擇性的環(huán)氧化物水解酶的真菌,得到一目的菌株層出鐮刀菌ZJUZQ010.對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:最佳碳、氮源分別是2.0%蔗糖和2.0%黃豆粉,初始p H為4.0;該酶不是誘導(dǎo)酶,2 mmol/L的Zn2+對(duì)其細(xì)胞生長(zhǎng)和酶的誘導(dǎo)激活作用顯著;當(dāng)轉(zhuǎn)化率為59.2%時(shí),剩余R型環(huán)氧化物的ee值為93.8%.

環(huán)氧化物水解酶;層出鐮刀菌ZJUZQ010;鄰甲氧基苯基縮水甘油醚;發(fā)酵;優(yōu)化

手性環(huán)氧化物及其水解產(chǎn)物鄰二醇作為現(xiàn)代手性醫(yī)藥品、農(nóng)用及精細(xì)化學(xué)品工業(yè)上各種生物活性物質(zhì)的重要中間體而受到越來越廣泛的關(guān)注[1-2].其制備方法有化學(xué)法和生物法.隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷提高,生物制備法將具有廣闊的應(yīng)用前景.

鄰甲氧基苯基縮水甘油醚(EM PP)是一種適用性很廣的芳基縮水甘油醚.它是β-腎上腺阻滯劑Mop rolol,防心絞痛藥物Ranolazine,鎮(zhèn)定劑M ephenoxalone,骨骼肌遲緩藥物M ethocarbamol及化痰藥Guaifenesin等的共同中間體[3].目前已有多種化學(xué)和生物方法用于合成光學(xué)純EM PP.但化學(xué)法經(jīng)常需使用重金屬元素等有毒物質(zhì)[4-5],對(duì)環(huán)境破壞很大,故其應(yīng)用也受到很大的限制.近年來,用生物催化法制備手性純化合物得到了較大的發(fā)展[6].EM PP含有一個(gè)含氧三元環(huán),其結(jié)構(gòu)表明該環(huán)氧化物能夠通過環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行拆分.環(huán)氧化物水解酶是一種不依賴于輔因子的酶,其來源廣泛,選擇性高[6-7],具有很高的工業(yè)化應(yīng)用前景.但目前尚未有關(guān)于用環(huán)氧化物水解酶拆分EM PP的報(bào)道.

該實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選出一株能高度對(duì)應(yīng)選擇性地水解EM PP的霉菌ZJUZQ010,對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 試 劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑購于浙江杭州華東醫(yī)藥股份公司,分析純產(chǎn)品.

1.2 菌 種

層出鐮刀菌ZJUZQ010由采自不同環(huán)境的土樣中篩選獲得.

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 篩選培養(yǎng)基 每1 000 m l培養(yǎng)基中含有2.0 g NH4NO3,1.5 g Na2HPO4·12H2O,1.5 g KH2PO4·3H2O,0.2 g M gSO4·7H2O,10 mg CaCl2,1.0 mg FeSO4·7H2O,0.1 mg ZnSO4·7H2O, 0.1 g酵母膏和0.1 g玉米粉,p H調(diào)節(jié)至6.0.250 m l錐形瓶裝30 m l培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min,冷卻后,每瓶加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的鄰甲氧基苯基縮水甘油醚.

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 每1 000 m l培養(yǎng)基中含有20 g玉米粉,20 g蔗糖,10 g NaCl,p H調(diào)節(jié)到4.0.

500 m l錐形瓶裝60 m l培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 EM PP的合成[8]

稱取1.2 g NaOH(0.03 mo l)加入到20 m l蒸餾水中,再稱取2.5 g鄰甲氧基苯酚(0.02 mol)加入到上述溶液,將混合物在室溫下攪拌約15 min后,逐滴加入7.4 g環(huán)氧氯丙烷(0.08 mol)和40 m l甲醇,之后在室溫下攪拌.反應(yīng)完全后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器抽去反應(yīng)物中的甲醇,再用等體積的乙酸乙酯萃取分層的剩余物3次.有機(jī)層用飽和NaHCO3和飽和食鹽水洗2次后用無水M gSO4干燥,過濾后用真空泵濃縮,得到一種淡黃色油狀液體,然后再用柱層析法進(jìn)行提純(展開劑:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1),得到一種無色的油狀液體(2.95 g,收率81.8%).

1.4.2 篩選 取土樣1.0 g,加入100 m l無菌水制成土壤懸浮液,搖20 min后靜置.取1.0 m l上清液,加到篩選培養(yǎng)基中,于30℃、200 r/min搖床上培養(yǎng)48 h.取出1.0 m l發(fā)酵液至新鮮的篩選培養(yǎng)基,重復(fù)前一過程3次后,用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液,在查氏平板培養(yǎng)基上劃線,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長(zhǎng)出菌落后,挑單一菌落轉(zhuǎn)查氏培養(yǎng)基斜面.

1.4.3 培養(yǎng)

將斜面接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,于30℃,200 r/min搖床上培養(yǎng)72 h后,紗布過濾,用無菌水沖洗3次,收集菌體,進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).

1.4.4 轉(zhuǎn)化

將收集的菌體加入15 m l 100 mmol/L,p H8.0的磷酸鉀緩沖液中,再加入0.75 m l EM PP的DM SO溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%).在30℃,200 r/min搖床上轉(zhuǎn)化30 min,對(duì)照不加菌體.

1.4.5 轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

將菌體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用相同體積的乙酸乙酯萃取3次,取有機(jī)層,無水M gSO4干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽干,加入流動(dòng)相溶解,進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)(274 nm波長(zhǎng)紫外檢測(cè),V(流動(dòng)相正己烷)∶V(異丙醇)=9∶1, 0.8 m l/min).制定鄰甲氧基苯酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.以鄰甲氧基苯酚作為外標(biāo),確定HPLC待測(cè)樣品中底物環(huán)氧化物和產(chǎn)物鄰二醇的濃度.

1.4.6 生物量的測(cè)定

取發(fā)酵液,減壓過濾,得菌體后水洗一次,于70～80℃烘干至恒重,稱重.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣品的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 篩 選

實(shí)驗(yàn)中以EM PP為唯一碳源進(jìn)行多輪富集,篩選目的微生物菌株.能以EM PP為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物菌株,理應(yīng)含有環(huán)氧化物(EH)水解酶活性.先進(jìn)行EH活性檢測(cè),再進(jìn)行下一步的對(duì)映體選擇性檢測(cè).

實(shí)驗(yàn)中,在不同的細(xì)菌、酵母菌及霉菌中均發(fā)現(xiàn)了含有環(huán)氧化物水解酶活性的菌株,但含有立體選擇性的菌株種類則很少.綜合考慮初步測(cè)定的轉(zhuǎn)化率及對(duì)映體選擇性,選取了霉菌菌株ZJUZQ010進(jìn)行下一步研究.經(jīng)生理生化及ITS基因序列測(cè)序分析,確定該菌株為層出鐮刀菌.

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

培養(yǎng)基成分對(duì)菌體細(xì)胞成長(zhǎng)和成長(zhǎng)過程中酶及其合成具有十分重要的影響.因此,該實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、金屬離子及其濃度、底物誘導(dǎo)5個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化.

2.2.1 碳源優(yōu)化

在含有2%玉米粉、1%NaCl的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2%不同碳源進(jìn)行發(fā)酵,分離菌體后進(jìn)行轉(zhuǎn)化,測(cè)定轉(zhuǎn)化率和菌體生物量,結(jié)果如圖1所示.

圖1 碳源對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率和生物量的影響Fig.1 Effect of carbon sources on conversion yield and biomass

碳源種類的比較表明,對(duì)于菌株ZJUZQ010,采用不同的碳源時(shí),其生物量和酶活表現(xiàn)出很大的差異.以蔗糖為碳源時(shí),雖然生物量不是最高,但是此條件下發(fā)酵獲得的菌體其環(huán)氧化物水解酶活性有了提高,且此轉(zhuǎn)化率下剩余環(huán)氧化物的光學(xué)純度最好.以β-環(huán)糊精和甘油為唯一碳源時(shí),雖然EH的活性很高,但此時(shí)剩余環(huán)氧化物的光學(xué)純度下降.

2.2.2 氮源優(yōu)化

根據(jù)上一步碳源優(yōu)化的結(jié)果,在含有2%蔗糖、1%NaCl的培養(yǎng)基中分別加入2%的不同無機(jī)氮源和有機(jī)氮源進(jìn)行發(fā)酵,收集菌體后進(jìn)行轉(zhuǎn)化,測(cè)定轉(zhuǎn)化率和菌體生物量.結(jié)果如圖2所示.

圖2 氮源對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率和生物量的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on conversion yield and biomass

氮源種類的比較表明,若培養(yǎng)基中使用無機(jī)氮化合物作為單一氮源,則經(jīng)過3 d培養(yǎng)后,發(fā)酵培養(yǎng)基中基本無菌體生長(zhǎng).這可能是因?yàn)樯L(zhǎng)前期,無機(jī)氮源被菌體迅速消耗,不能滿足菌體持續(xù)生長(zhǎng)的需要.而對(duì)于有機(jī)氮源,該菌體的生物量和酶活表現(xiàn)出較大的差異.以豆餅粉為氮源時(shí),無論生物量還是轉(zhuǎn)化率,都是最高的,玉米粉其次,但兩者的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物剩余環(huán)氧化物的光學(xué)純度較低.而以蛋白胨作為氮源時(shí),雖菌體生物量較大,但其轉(zhuǎn)化率卻偏低.因此,從菌體生物量、轉(zhuǎn)化率及剩余環(huán)氧化物的光學(xué)純度3個(gè)方面考慮后,選擇黃豆粉作為該菌株發(fā)酵用氮源.

2.2.3 不同金屬離子的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)中分別加入1 mmol/L的不同金屬離子,然后進(jìn)行發(fā)酵,收集菌體后進(jìn)行轉(zhuǎn)化,測(cè)定生物量和轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖3所示.

圖3 金屬離子對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率和生物量的影響Fig.3 Effect of metal ions on conversion yield and biomass

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Fe2+不利于細(xì)胞的生長(zhǎng),但是轉(zhuǎn)化率卻明顯提高.Ba2+和Ca2+能提高菌體生物量,但是該條件下的轉(zhuǎn)化率卻下降了.在實(shí)驗(yàn)的8種金屬離子中,除Fe2+外,Zn2+、A l3+和Cu2+條件下獲得的菌體其轉(zhuǎn)化能力也有明顯提高,但生物量無明顯變化.此處環(huán)氧化物水解酶轉(zhuǎn)化能力的提高,有可能是因?yàn)榧?xì)胞體內(nèi)該種酶含量增加,也有可能是金屬離子使得酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而導(dǎo)致其活性提高,還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

綜合考慮生物量、轉(zhuǎn)化率及剩余環(huán)氧化物的光學(xué)純度,選擇Zn2+進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

2.2.4 金屬離子濃度的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入1,2,3,4,5,6 mmol/L的Zn2+進(jìn)行發(fā)酵,收集菌體后進(jìn)行轉(zhuǎn)化,測(cè)定生物量和轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖4所示.

圖4 Zn2+離子濃度對(duì)菌體生物量和轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of Zn2+concentration on conversion yield and biomass

結(jié)果表明,對(duì)于該菌株,2 mmol/L的Zn2+對(duì)其生物量和轉(zhuǎn)化率都有明顯的促進(jìn)作用,此條件下生物量最佳,雖轉(zhuǎn)化率不是最高,但是剩余環(huán)氧化物的光學(xué)純度最高.從圖4可以看出,1～4 mmol/L的Zn2+濃度范圍內(nèi),細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力都有明顯提高,而生物量從3 mmol/L開始呈下降趨勢(shì).5 mmo l/L開始,無論轉(zhuǎn)化率還是生物量,都明顯下降,這說明過高的Zn2+濃度已經(jīng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用.

2.2.5 底物的誘導(dǎo)作用

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%的EM PP,以不加EM PP為對(duì)照,進(jìn)行發(fā)酵和菌體轉(zhuǎn)化,測(cè)定轉(zhuǎn)化率.結(jié)果表明,在發(fā)酵過程中加入底物,使菌體生物量明顯降低,除含0.1%EM PP的培養(yǎng)基外,其余培養(yǎng)基中幾乎無細(xì)胞生長(zhǎng),可能是環(huán)氧化物對(duì)細(xì)胞的毒害作用所致.含0.1%EM PP的發(fā)酵瓶中,生物量也降低,分析收集所得的菌體,其酶活也有下降.這說明該菌株對(duì)環(huán)氧化物較敏感,且該酶為非誘導(dǎo)酶.

3 結(jié) 論

以鄰甲氧基苯基縮水甘油醚為唯一碳源,從土壤中篩選出一株具有立體選擇性環(huán)氧化物水解酶的菌株,經(jīng)鑒定該菌株為層出鐮刀菌.之后對(duì)其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,最佳碳、氮源分別是2.0%蔗糖和2.0%黃豆粉,初始p H為4.0,且該酶不是誘導(dǎo)酶,2 mmol/L的Zn2+對(duì)其細(xì)胞生長(zhǎng)和酶的誘導(dǎo)激活作用顯著.最終,該發(fā)酵條件下獲得的菌株整細(xì)胞對(duì)鄰甲氧基苯基縮水甘油醚進(jìn)行底物轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率為59.2%,剩余R型環(huán)氧化物ee值為93.8%.

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Research on the Screen ing and Fermen tation Conditions of Botryosphaeria Dothidea with Enan tioselective Epoxide Hydrolase

SHENG Yan-min,ZHANG Zheng-fang,WANG Shan,ZHU Qing
(College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

Considering glycidylmethoxyl phenyl ethers as the unique carbon source,the paper has screened the fungiof epoxide hydrolase w ith stereoselectivity from soil,and obtained Fusarium proliferatum ZJUZQ 010.After op timizing its fermentation conditions,the results show that the best carbon source is 2.0%sucrose,the best nitrogen source is 2.0% soybean meal,the initial p H is 4.0,and the epoxide hydrolase is not induced enzyme in this strain.2 mmol/L Fe2+is good fo r auxesis as well as the induction and activation of enzyme.When the fractional conversion is 59.2%,the ee value of rest (R)-enantiomer is 93.8%.

epoxide hydrolase;Fusarium proliferatum ZJUZQ010;glycidyl methoxyl phenyl ethers;fermentation; op timization

Q 939.97

A

1674-232X(2010)03-0215-05

DO I:10.3969/j.issn.1674-232X.2010.03.011

2010-03-17

錢江杰出人才計(jì)劃(2006R10016);浙江省自然科學(xué)基金(Y2080303).

盛艷旻(1985—),女,浙江金華人,發(fā)酵工程專業(yè)碩士研究生,從事環(huán)氧化物水解酶用于手性拆分方面的研究.＊

朱 勍(1970—),男,浙江金華人,教授,從事化學(xué)生物學(xué)、生物轉(zhuǎn)化的研究.E-mail:zhuq@zjut.edu.cn