王健,邱麗媛,張文君,段翠密,郝彤,林秋霞,王常勇

海藻酸微囊包裹同種來(lái)源、異種來(lái)源的細(xì)胞或基因工程化細(xì)胞后可以較為有效地截割大分子的免疫活性物質(zhì)進(jìn)入微囊內(nèi)部,避免細(xì)胞體內(nèi)移植后引發(fā)的免疫排斥反應(yīng);而允許小分子的營(yíng)養(yǎng)物、分泌物等通過(guò),使被包裹的細(xì)胞獲得各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并正常行使其細(xì)胞生理功能,在各種疾病或代謝功能失調(diào)的治療上具有廣闊的應(yīng)用前景。如:微囊化異體多巴胺能神經(jīng)元用于治療帕金森病[1],微囊化牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞用于移植治療晚期癌痛[2],微囊化軟骨細(xì)胞治療骨軟骨缺損性疾病[3];特別是微囊化胰島細(xì)胞用于治療糖尿病[4],微囊化肝細(xì)胞移植治療肝功能衰竭和某些先天性肝代謝疾病[5-6]的深入研究使得微囊化技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

二價(jià)或多價(jià)陽(yáng)離子是重要的海藻酸微囊制備材料,與海藻酸結(jié)合的陽(yáng)離子的種類直接影響微囊的性能,通常使用最為廣泛的是Ca2+。李洪波等報(bào)道使用Ba2+替代Ca2+,制備的BPA微囊較之于APA微囊具備更好機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性[7-8]。另外,多聚氨基酸是另一種重要的海藻酸微囊制備材料,其中以多聚賴氨酸(PLL)使用最為廣泛。但也有報(bào)道指出,多聚賴氨酸會(huì)導(dǎo)致微囊膜黏附成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[9],降低微囊的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和生存力。根據(jù)Marcus等的報(bào)道使用多聚鳥氨酸(PLO)制備的APA微囊比多聚賴氨酸制備的APA微囊具有更好的物理性能,更好的生物相容性[10-11]。在此基礎(chǔ)之上,我們選用多聚鳥氨酸作為制囊多聚氨基酸,替代傳統(tǒng)的多聚賴氨酸,優(yōu)化制囊條件,制備出海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(Ba-alginate-Poly-L-Ornithine-Alginate microcapsules,B-PLO-A)微囊,對(duì) PLO-和 PLL-包被的海藻酸鋇微囊的物理性能和生物相容性進(jìn)行了對(duì)比。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 VARV1型靜電微囊發(fā)生儀(瑞典NISCO公司);搖床(江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、海藻酸鈉(Sigma-Aldrich)、氯化鋇(Fluca)、多聚鳥氨酸(PLO HCl)(MW 1/4 15～30 kDa,Sigma-Aldrich)、多聚賴氨酸(Mw 1/4 15～30 kDa Sigma-Aldrich);枸櫞酸鈉(天津化學(xué)試劑一廠,分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠,體重180～200 g,雌雄兼有,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 微囊制備 用靜電微囊發(fā)生儀將2%海藻酸鈉溶液噴入氯化鋇溶液中,作用2 min,以形成海藻酸鋇微球。吸出氯化鋇溶液,使用生理鹽水洗滌2次(盡量將游離態(tài)Ba2+去除),再將微球分別與多聚鳥氨酸溶液/多聚賴氨酸反應(yīng)數(shù)分鐘,形成B-PLO-A和 B-PLL-A微球,再使用生理鹽水洗滌2次;之后,將兩種微膠珠與0.05%的海藻酸鈉溶液反應(yīng)數(shù)分鐘,中和微膠珠表面的正電荷,再將B-PLO-A和B-PLL-A微膠珠與枸櫞酸鈉溶液反應(yīng)數(shù)分鐘,液化囊芯,形成B-PLO-A和B-PLL-A微囊。

1.4 微囊在低滲環(huán)境的變化 分別將50個(gè)B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入盛有10 ml蒸餾水的平皿內(nèi),于37℃孵育2 h,然后用生理鹽水洗滌,再向平皿內(nèi)滴加0.5%臺(tái)盼藍(lán)2滴,搖勻,使微囊著色,以得到清晰的微囊輪廓。染色后繼續(xù)以生理鹽水洗滌,在光鏡下觀察微囊形態(tài),記錄孵育前后微囊直徑的變化,統(tǒng)計(jì)破損率。

1.5 微囊直徑變化測(cè)定 分別將100個(gè)B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入50 ml生理鹽水的100 ml燒杯中,封口膜將杯口封閉,于37℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng) 2周 ,分別在 0、2 d、4 d、6 d、8 d 、10 d 、12 d 、14 d 時(shí)取樣,在光鏡下計(jì)數(shù)B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊數(shù)量,統(tǒng)計(jì)微囊直徑變化。

1.6 微囊體外機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)定 分別將450個(gè)BPLO-A微囊和B-PLL-A微囊放入50 ml生理鹽水的100 ml燒杯中,封口膜將杯口封閉,于37℃,150 r/min的速度下在搖床上進(jìn)行震蕩。分別于12 h、24 h、36 h、48 h、96 h取樣,于光鏡下記錄 B-PLO-A 微囊和B-PLL-A微囊數(shù)、破損數(shù)量,同一批制備的微囊重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次,計(jì)算完整率。

1.7 B-PLO-A微囊生物相容性的測(cè)定 將B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊,植入SD大鼠腹腔內(nèi),分別于移植后1,2,4和8周,打開腹腔,肉眼觀察微囊在腹腔內(nèi)的分布情況。用生理鹽水注射沖洗腹腔,回收微囊,在光鏡下觀察微囊的形態(tài),同一批制備的微囊重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次,計(jì)算完整率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0進(jìn)行單因素方差分析,顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊的形態(tài) 所制作的B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊在光鏡下呈透明圓球形,膜表面光滑,微囊大小較均勻,直徑為350～500 μ m,兩者無(wú)明顯差異。見封三彩圖1.1。

2.2 微囊在低滲環(huán)境的變化 B-PLO-A微囊和BPLL-A微囊在蒸餾水的滲透應(yīng)力作用下均呈現(xiàn)了一定的尺寸增長(zhǎng)趨勢(shì),其中B-PLO-A微囊的直徑由孵育前的(429±14)μ m,增大為(464±14)μ m,B-PLL-A微囊的直徑由孵育前的(453±13)μ m,增大為(518±24)μ m,臺(tái)盼藍(lán)染色顯示B-PLL-A微囊表面出現(xiàn)部分破損變形現(xiàn)象,B-PLO-A微囊的破損率為16.98%,BPLL-A微囊的破損率為34.54%。見封三彩圖1.2。

2.3 微囊直徑變化測(cè)定 B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊于37℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2周,直徑初期均出現(xiàn)明顯增大,4 d后直徑變化趨緩,直至14 d直徑變化趨于穩(wěn)定;初期0～2 d內(nèi)B-PLO-A微囊直徑增大明顯小于B-PLL-A微囊。

2.4 微囊的體外機(jī)械強(qiáng)度 B-PLO-A微囊經(jīng)機(jī)械振蕩搖 12 h、24 h、36 h、48 h、96 h 的完整率分別為100%、100%、100%、99.5±0.9%、99.3±1.0%。BPLL-A微囊經(jīng)機(jī)械振蕩12 h時(shí)的完整率為100%,24 h時(shí)完整率為100%,36 h時(shí)完整率為(99.1±2.6)%,48 h時(shí)完整率為(97.9±1.7)%,96 h完整率(96.2±1.5)%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,B-PLO-A微囊的機(jī)械強(qiáng)度在96 h后高于B-PLL-A微囊,表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。見表1。

表1 機(jī)械震蕩不同時(shí)間后B-PLL-A微囊和B-PLO-A微囊的完整率(n=50,%)

2.5 生物相容性 將B-PLO-A空微囊和B-PLL-A空微囊分別植入大鼠腹腔,于1、2、4和8周后打開腹腔,肉眼觀察見植入B-PLO-A空微囊和B-PLL-A空微囊的大鼠,腹腔內(nèi)表面及腹腔臟器表面均為光滑,無(wú)明顯的異常結(jié)節(jié),網(wǎng)膜血管附近有少量微囊附著。從腹腔內(nèi)回收的兩種微囊體積均超過(guò)植入微囊體積的90%。微囊呈透明圓球形,膜表面光滑,無(wú)結(jié)締組織包繞。見封三圖1.4。膜表面有結(jié)締組織包繞及少量細(xì)胞黏附,無(wú)明顯差異。各回收時(shí)間點(diǎn)微囊完整率見表2。

表2 植入大鼠體內(nèi)不同回收時(shí)間B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊的完整率(%)

3 討論

海藻酸遇二價(jià)或多價(jià)陽(yáng)離子,如:Ca2+或Ba2+,可與其古洛糖醛酸區(qū)域內(nèi)的羥基結(jié)合生成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以Ba2+替代Ca2+制備的BPA微囊已被證明具有更好的機(jī)械性能和生物相容性[7-8],原因是:在與海藻酸凝結(jié)成膠體的陽(yáng)離子中,Ba2+離子毒性最小,與海藻酸的結(jié)合力較Ca2+更強(qiáng)[12],使得BPA微囊的長(zhǎng)期穩(wěn)定性能更為優(yōu)越。低穩(wěn)定性的微囊,在體內(nèi)環(huán)境下容易發(fā)生形變,而誘發(fā)宿主纖維組織的包繞[13-15],因此,BPA微囊良好的物理穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度又為其提供較好的生物相容性。還有研究表明,微囊的生物相容性很大程度上依靠其囊膜上多聚陽(yáng)離子與海藻酸的結(jié)合效率[8],多聚鳥氨酸(PLO)以其與海藻酸更短的結(jié)合鍵,增強(qiáng)了這種結(jié)合效率,使得多聚鳥氨酸海藻酸(A-PLO-A)微囊具備比多聚賴氨酸海藻酸(A-PLLA)微囊更為優(yōu)秀的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性[10,16]。

本研究旨在將BPA微囊與PLO結(jié)合,制備出BPLO-A微囊,將其與使用PLL制備的BPA微囊進(jìn)行物理性能和生物相容性比較,探討PLO用于BPA微囊的制備對(duì)其性能的影響。體外檢測(cè)結(jié)果表明,PLO與海藻酸更高的結(jié)合效率進(jìn)一步增強(qiáng)微囊的機(jī)械強(qiáng)度,提高微囊抵御低滲環(huán)境的能力,對(duì)于維持微囊形態(tài)穩(wěn)定,保護(hù)包裹在其中的細(xì)胞提供保證;在體外培養(yǎng)14 d后,B-PLO-A微囊直徑變化較B-PLL-A微囊更小,說(shuō)明B-PLO-A微囊的囊膜更為穩(wěn)定,能夠更為有效地抵御形變的發(fā)生,減少宿主纖維組織包繞的發(fā)生,為微囊化細(xì)胞長(zhǎng)期生存創(chuàng)造了潛在條件。同時(shí),在植入大鼠腹腔2個(gè)月后,大部分B-PLO-A微囊仍然保持原有的形態(tài),微囊完整、無(wú)結(jié)締組織包繞,表明B-PLOA微囊除物理性能較傳統(tǒng)的BPA微囊有所提高,其生物相容性良好。

綜上所述,我們制備的B-PLO-A微囊在B-PLLA微囊基礎(chǔ)上,體現(xiàn)出更好的物理性能,并保持良好的生物相容性,是一種極具應(yīng)用前景的生物材料,為微囊化細(xì)胞治療提供了新的思路。

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