胡大強(qiáng)（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶市 400042）

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域修飾小鼠干擾素-γ的研制

胡大強(qiáng)＊（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶市 400042）

目的：制備蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域修飾小鼠干擾素-γ（PTD-mIFN-γ），為研究PTD-mIFN-γ功能作準(zhǔn)備。方法：以質(zhì)粒pUC19/ mIFN-γ為模板，經(jīng)3輪聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增編碼PTD-mIFN-γ片段，克隆于質(zhì)粒pUC19上，測(cè)序鑒定正確后構(gòu)建到pQE80L表達(dá)質(zhì)粒載體中，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Western blot法檢測(cè)表達(dá)的目的蛋白，鎳離子-次氨基三乙酸（Ni2＋-NTA）凝膠親和層析純化重組蛋白，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)PTD-mIFN-γ。結(jié)果：PCR擴(kuò)增得到編碼PTD-mIFN-γ的cDNA，SDS-PAGE和Western blot法分析顯示重組蛋白獲得了高效表達(dá)，ELISA法檢測(cè)出目的蛋白。結(jié)論：成功制備了PTD-mIFN-γ。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；干擾素-γ；蛋白純化；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

干擾素-γ（Interferon gamma，INF-γ）具有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用[1]，臨床已廣泛使用。臨床上人IFN-γ主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗肝纖維化治療。大量研究[2]顯示IFN-γ對(duì)防治尋常疣和皮膚瘢痕增生是有益的，但常規(guī)肌肉注射或者靜脈給藥可降低患者依從性，如果能制備成乳膏，直接外用可能將增加其應(yīng)用范圍。然而，因?yàn)镮FN-γ的分子量超過(guò)1萬(wàn)，皮膚對(duì)其吸收有屏蔽作用，從而限制了IFN-γ在尋常疣、皮膚疤痕增生外用給藥的應(yīng)用。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（Protein transduction domain，PTD）強(qiáng)大的跨膜遞送功能的發(fā)現(xiàn)為克服上述方法中的不足提供了可能。本文選擇PTD作為人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ）的反式激活因子（TAT）的11肽[3]（氨基酸序列47～57，YGRKKRRQRRR），采用基因工程技術(shù)，將PTD連接于小鼠IFN-γ（mIFN-γ）N端，為進(jìn)一步研究PTD-mIFN-γ跨皮膚遞送等功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

測(cè)序質(zhì)粒pUC19、pUC19/mIFNγ，表達(dá)質(zhì)粒pQE80L和DH5α菌株，均由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥理室保存。

1.2 試藥與儀器

Tripure RNA提取試劑（美國(guó)Roche公司）；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA聚合酶、T4連接酶（大連寶生物公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段膠回收和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物回收試劑盒（美國(guó)Omega公司）；引物由上海生工公司合成；抗His單抗和鎳離子-次氨基三乙酸（Ni2+-NTA）層析系統(tǒng)（德國(guó)Qiagen公司）；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，美國(guó)Sigma公司）；小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成

設(shè)計(jì)擴(kuò)增PTD-mIFN-γ引物，上、下游引物分別選用BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

引物1：5′-TCTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCC-3′；引物2：5′-GAGACAGCGACGAAGACACGGCACAGTCATT-3′；引物3：5′-GAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA-3′；引物4：5′-GAGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAG-3′。

1.4 PCR法擴(kuò)增編碼PTD-mIFN-γ cDNA片段

小量法提取測(cè)序正確的pUC19/mIFN-γ質(zhì)粒作為第1輪PCR擴(kuò)增模板，第2輪和第3輪PCR擴(kuò)增模板分別為前一輪PCR產(chǎn)物；下游引物均為引物1分別與上游引物2～4組成3對(duì)引物，依次經(jīng)3輪PCR擴(kuò)增得到編碼PTD-mIFN-γ片段。PCR反應(yīng)條件為：94℃、5 min激活熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，然后94℃、30 s，63℃、30 s，72℃、1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶酶切，回收目的片段構(gòu)建到pUC19質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌，藍(lán)白斑篩選，挑選白斑單克隆接種培養(yǎng)后，小量法提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，對(duì)含陽(yáng)性重組質(zhì)粒細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序。

1.5 pQE80L/PTD-mIFN-γ表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序正確的pUC19/PTD-mIFN-γ質(zhì)粒經(jīng)小量法提取，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后瓊脂糖電泳膠回收PTD-mIFN-γ片段，構(gòu)建于pQE80L，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌，氨芐青霉素抗性篩選，挑選轉(zhuǎn)化單克隆接種培養(yǎng)后，小量法提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆。

1.6 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取含重組原核表達(dá)載體的單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)液中37℃、225 r·min－1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1%接種到5 mL LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)至吸光度（A600）為0.6時(shí)，加IPTG至終濃度為1 mmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取上述培養(yǎng)液1 mL，10 000 r·min－1離心1 min，沉淀行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。取含重組原核表達(dá)載體的細(xì)菌50 mL，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，操作同“挑取”至“繼續(xù)培養(yǎng)4 h”止，菌液離心后，棄去上清液，超聲碎菌，功率為總功率的28%，工作時(shí)間2 s，間隔時(shí)間2 s，碎菌16 min。碎菌液10 000 r·min－1、4℃離心15 min，收集上清液和沉淀分別行SDS-PAGE。SDS-PAGE參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[4]進(jìn)行，使用15%的聚丙烯酰胺分離膠和5%濃縮膠，鑒定融合蛋白。

1.7 Western blot法

經(jīng)誘導(dǎo)的pQE80L/PTD-mIFN-γ/DH5α及pQE80L/DH5α（陰性對(duì)照）工程菌行SDS-PAGE后，將凝膠上的蛋白經(jīng)半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，麗春紅S染色后標(biāo)出marker的位置，去離子水洗去膜上的麗春紅S，5%脫脂奶粉室溫封閉，加抗His單抗孵育，洗滌后加辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的第二抗體室溫孵育1 h，洗膜后加3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）閉光顯色。

1.8 Ni2+-NTA凝膠親和層析柱純化蛋白及蛋白含量測(cè)定

將含pQE80L/PTD-mIFN-γ質(zhì)粒的表達(dá)菌株接種于500 mL LB培養(yǎng)中液中進(jìn)行表達(dá)（方法同“1.6”項(xiàng)），離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌，Lysis緩沖液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1咪唑，NaOH調(diào)至pH 8.0）懸浮細(xì)菌，并加入溶菌酶置于冰上30 min后超聲波破碎菌體，離心得到上清液。上清液過(guò)Ni2+-NTA凝膠層析柱，用Lysis緩沖液和Wash緩沖液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，20 mmol·L－1咪唑，NaOH調(diào)至pH 8.0）洗柱，直至吸光度A280小于0.01，Elution緩沖液（50 mmol·L－1NaH2PO4，300 mmol·L－1NaCl，250 mmol·L－1咪唑，NaOH調(diào)至pH 8.0）洗脫目的蛋白。行SDS-PAGE分析，透析純化蛋白。純化的蛋白冷凍干燥后－20℃保存。

冷凍干燥的PTD-mIFN-γ蛋白為白色疏松粉末，蛋白含量測(cè)定使用小鼠IFN-γ ELISA試劑盒，采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定。精密稱取純化蛋白用0.01mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解并稀釋到15～2 000 pg·mL－1濃度范圍內(nèi)，mIFN-γ ELISA試劑盒測(cè)定，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增編碼

3輪PCR擴(kuò)增后得到的PTD-mIFN-γ片段，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后顯示在440 bp處有特異擴(kuò)增條帶，大小與理論值[5]一致，見(jiàn)圖1。

圖11.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PTD-mIFN-γ PCR產(chǎn)物Fig 1 Electrophoresis identification of PCR product of PTD-mIFN-γ in 1.2%agarose gel

測(cè)序結(jié)果為T(mén)ATGGCAGGA AGAAGCGGAG ACAGCGACGA AGA CACGGCA CAGTCATTGA AAGCCTAGAA AGCCTGAATA ACTATTTTAA CTCAAGTGGC ATAGATGTGG AAGAAAAGAG TCTCTTCTTG GATATCTGGA GGAACTGGCA AAAGGATGGT GACATGAAAA TCCTGCAGAG CCAGATTATC TCTTTCTACC TCAGACTCTT TGAAGTCTTG AAAGACAATC AGGCCATCAG CAACAACATAAGCGTCATTG AATCACACCT GATTACTACC TTCTTCAGCA ACA GCAAGGC GAAAAAGGAT GCATTCATGA GTATTGCCAAGTTTGAGGTC AACAACCCAC AGGTCCAGCG CCAAGCATTC AATGAGCTCA TCCGAGTGGT CCACCAGCTG TTGCCGGAAT CCAGCCTCAG GAAGCGGAAA AGGAGTCGCT GCTGA，顯示與理論值[5]一致。

2.2 pQE80L/PTD-mIFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建

pQE80L/PTD-mIFN-γ經(jīng)雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示在440 bp和4.7 kb各有一條帶，證明pQE80L/PTD-mIFN-γ成功構(gòu)建，詳見(jiàn)圖2。

圖2 pQE80L/PTD-mIFN-γ雙酶切電泳圖Fig 2 Electrophoresis of pQE80L/PTD-mIFN-γ double digested

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

pQE80L/PTD-mIFN-γ質(zhì)粒的DH5α菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)了重組目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白主要存在于上清液，說(shuō)明PTD-mIFN-γ主要以可溶性形式存在于細(xì)菌中，詳見(jiàn)圖3。

2.4 Western blot法分析結(jié)果

經(jīng)誘導(dǎo)的菌體裂解物與抗His單抗反應(yīng)，在分子量約1.7×104Da處出現(xiàn)單一條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體則無(wú)此反應(yīng)，說(shuō)明所表達(dá)蛋白為PTD-mIFN-γ，詳見(jiàn)圖4。

2.5 蛋白的純化與含量測(cè)定

圖3 PTD-mIFN-γ蛋白表達(dá)SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE for expression of PTD-mIFN-γ protein

圖4 重組蛋白的免疫印跡分析Fig 4 Western blot analysis of recombinant protein

表達(dá)蛋白經(jīng)Ni2+-NTA凝膠純化后行SDS-PAGE，結(jié)果電泳譜中呈單一條帶，說(shuō)明目的蛋白得到了純較高程度純化，mIFN-γ ELISA試劑盒檢測(cè)出PTD-mIFN-γ的含量為39%。SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 PTD-mIFN-γ的SDS-PAGE圖Fig 5 SDS-PAGE of PTD-mIFN-γ

3 討論

IFN-γ為T(mén)h細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等功能。臨床上可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療和抗纖維化治療，抗腫瘤及病毒治療是其研究的新方向。PTD是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中能高效穿過(guò)膜結(jié)構(gòu)的多肽分子，除可介導(dǎo)蛋白分子、多肽等物質(zhì)跨越皮膚遞送外，還可高效穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[6]以及跨越血腦屏障[7]進(jìn)行物質(zhì)遞送。PTD與多肽或蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合，實(shí)現(xiàn)藥物跨膜遞送功能。PTD富含堿性精氨酸，α螺旋可使精氨酸殘基構(gòu)像優(yōu)化從而增加轉(zhuǎn)運(yùn)效率[8]。

小鼠IFN-γ的N末端對(duì)蛋白的功能影響較大，PTD/TAT 11肽的位置不影響融合蛋白的功能，所以本文在編碼mIFN-γ cDNA的5′端加上編碼PTD的33個(gè)堿基，進(jìn)而制備PTD-mIFN-γ，重組蛋白的表達(dá)菌株選擇大腸桿菌DH5α，大腸桿菌中的細(xì)菌酶會(huì)特異分解mIFN-γ的C末端，如果PTD構(gòu)建在mIFN-γ的C端，因融合蛋白的分離純化采用親和層析，標(biāo)簽His肽在蛋白的N端，制備的蛋白含有未連接PTD的野生干擾素，使目的蛋白不純，進(jìn)而影響其生物學(xué)活性。有關(guān)PTD/ TAT構(gòu)建在mIFN-γ C端的實(shí)驗(yàn)工作已經(jīng)完成，相關(guān)文章已發(fā)表[9]。本文采用PCR技術(shù)，通過(guò)3輪PCR擴(kuò)增得到編碼PTD-mIFN-γ cDNA片段，易于操作，方便可行。選擇表達(dá)載體pQE80L可提高目的蛋白的表達(dá)量，并且表達(dá)的PTD-mIFN-γ為可溶性蛋白，能保持天然活性。由于表達(dá)蛋白N端含有6個(gè)His標(biāo)簽，可用Ni2+-NTA凝膠親和層析柱純化目的蛋白，操作簡(jiǎn)便可行。

[1]Smith O，Mayhew E，Reszka R，et al.Antiviral and antiproliferative properties of liposome-associated human interferon-γ[J].J Interferon Res，1990，10（2）：153.

[2]楊靜，李惠.皮損內(nèi)注射重組人干擾素γ治療尋常疣[J].藥學(xué)進(jìn)展，2006，30（6）：280.

[3]Zhang XY，Dinh A，Cronin J，et al.Cellular uptake and lysosomal delivery of galactocerebrosidase tagged with the HIV Tat protein transduction domain[J].J Neurochem，2008，104（4）：1 055.

[4]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].第2版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999：379～384.

[5]Gray PW，Goeddel DV.Cloning and expression of murine immune interferon cDNA[J].Proc Natl Acad Sci，1983，80（19）：5 842.

[6]Guelen L，Paterson H，Gaken J，et al.TAT apoptin is efficiently delivered and induces apoptosis in cancer cells[J].Oncogene，2004，23（5）：1 153.

[7]Popiel HA，Nagai Y，F(xiàn)ujikake N，et al.Protein transduction domain-mediated delivery of QBP1 suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in vivo[J].Mol Ther，2007，15（2）：303.

[8]Fan YF，Lu CZ，Xie J，et al.Apoptosis inhibition in ischemic brain by intraperitoneal PTD-BIR3-RING（XIAP）[J].Neurochemistry International，2006，48（1）：50.

[9]胡大強(qiáng)，何鳳田，鄭英如，等.TAT修飾的小鼠IFNγ的制備[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（8）：795.

Preparation of Protein Transduction Domain Modified Mice IFN-γ

HU Da-qiang（Dept.of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of The Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To prepare PTD modified mice interferon gamma（PTD-mIFN-γ）in order to prepare for its function research.METHODS：The code of PTD-mIFN-γ fragment was amplified by PCR for 3 times，using pUC19/mIFN-γ as template. The PCR product was cloned into pUC19 plasmid and then constructed into expression plasmid vector pQE80L after sequencing.After double digestion with BamHⅠand HindⅢ，the recombinant vector was identified in 1.2%agarose gel.The target protein and PTD-mIFN-γ was checked by SDS-PAGE，Western blot method and ELISA assay，respectively.Recombinant protein was purified by nikel ion-triglycollamic acid（Ni2＋-NTA）Agarose affinity chromatogram.RESULTS：The cDNA fragment encoding PTD-mIFN-γ amplified by PCR was obtained.The high-level expression of recombinant protein was noted in SDS-PAGE and Western blot assay.The target protein was obtained by ELISA assay.CONCLUSION：PTD-mIFN-γ was prepared successfully.

Protein transduction domain；IFN-γ；Protein purification；ELISA

R 965；R979.5

A

1001-0408（2010）01-0047-03

2009-02-18

2009-04-17）

＊主管藥師，碩士。研究方向：抗腫瘤藥物。電話：023-68898867。E-mail：dph.hdq@163.com