施益芬，俞康，陳怡，任行洲，畢來(lái)喜，錢(qián)紅蘭

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325000)

氫醌對(duì)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPO Ⅱα表達(dá)的影響及其可能機(jī)制

施益芬，俞康，陳怡，任行洲，畢來(lái)喜，錢(qián)紅蘭

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325000)

目的：觀(guān)察苯代謝物氫醌(hydroquinone，HQ)對(duì)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（TOPO Ⅱα）表達(dá)的影響，探討TOPO Ⅱα在HQ所致造血毒性中的作用及其調(diào)控機(jī)制。方法：50μmol/L HQ培養(yǎng)10 h的正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，等體積滅菌蒸餾水培養(yǎng)10 h為對(duì)照組。Western blot測(cè)定TOPOⅡα含量的變化，RT-PCR測(cè)定TOPOⅡαmRNA表達(dá)水平的改變，ChIP技術(shù)觀(guān)察HQ對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOⅡα啟動(dòng)子組蛋白乙酰化、甲基化水平的影響。結(jié)果：①與對(duì)照組相比，人骨髓單個(gè)核細(xì)胞50μmol/L HQ處理10 h后，TOPOⅡα含量、TOPOⅡαmRNA水平明顯下降，差異有顯著性(P＜0.01）；②TOPOⅡα含量降低伴隨著TOPOⅡα啟動(dòng)子組蛋白H4乙?；?、組蛋白H3K4甲基化水平的明顯降低(P＜0.01）、組蛋白H3K9甲基化水平升高(P<0.05)，不伴有組蛋白H3乙?；降母淖儯≒＞0.05）。結(jié)論：HQ能抑制造血細(xì)胞TOPOⅡα的表達(dá)；組蛋白化學(xué)修飾可能在苯代謝物所致的造血毒性中發(fā)揮一定的作用。

氫醌類(lèi)；拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα；組蛋白乙?；?；組蛋白甲基化；染色質(zhì)免疫沉淀分析

苯是明確的職業(yè)致癌物之一。苯誘發(fā)的造血系統(tǒng)疾病發(fā)病率高。盡管苯所致造血毒性已得到廣泛重視，但其毒性機(jī)制仍未闡明。近年來(lái)，拓?fù)洚悩?gòu)酶在苯致造血毒性中的作用日益受到關(guān)注[1-2]。氫醌（hydroquinone，HQ）是苯在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物之一，因此，利用HQ研究苯造血毒性機(jī)制，探討拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα（TOPOIIα）在HQ所致造血毒性中的作用及其調(diào)控機(jī)制具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象正常志愿者捐獻(xiàn)的骨髓20份。志愿者年齡20～35歲，平均27歲，其中男11例，女9例。本研究已通過(guò)溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)證。所有骨髓捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書(shū)。1.2實(shí)驗(yàn)材料TOPOIIα檢測(cè)試劑盒、兔抗人TOPOIIα抗體（美國(guó)TopoGen公司），SuperECL Plus Western Blot超敏發(fā)光液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國(guó)Pierce公司），ChIP assay kit、抗乙?；M蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體 (美國(guó)Upstate公司)，37%甲醛（美國(guó)Sigma公司），1，4-氫醌AR（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），HQ先以10 mL滅菌雙蒸水溶解，配制成0.1 mol/L的原溶液，滅菌后4 ℃冰箱避光保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)：取健康志愿獻(xiàn)髓員的骨髓5 mL，肝素抗凝（50 U/mL），淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液。臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)活細(xì)胞率，要求拒染率達(dá)95%以上。骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106/mL。培養(yǎng)液為體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組：培養(yǎng)板各孔均加入2×1640液2 mL、胎牛血清液0.4 mL、滅菌雙蒸水1.48 mL、分離制備的骨髓單個(gè)核細(xì)胞4×106。實(shí)驗(yàn)組加入用滅菌雙蒸水稀釋60倍后的終濃度為50μmol/L的HQ溶液120 μL，對(duì)照組加入等量的滅菌雙蒸水(設(shè)立平行樣，各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的標(biāo)本為同一來(lái)源)。培養(yǎng)10 h 后，等滲PBS液洗2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL備用。1.3.3核蛋白的提?。菏占撬鑶蝹€(gè)核細(xì)胞（3× 107～5×107）（注：因細(xì)胞需要量大，標(biāo)本為多個(gè)同組標(biāo)本收集后混合），加入1 mL冰冷的buffer A（10 mmol/L Hepes，pH 7.9，10 mmol/L KCl，0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L EGTA，0.5 mmol/L PMSF），冰上裂解15 min，加入62.5μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% NP-40，劇烈震蕩15 s，10000 r/min離心30 s，核沉淀重懸于50μL冰冷的buffer B(20 mM Hepes，pH 7.9，0.4 M NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF)，劇烈震蕩15 min，4 ℃15000 r/min 離心5 min，上清液即核蛋白提取液，－70 ℃保存。

1.3.4Western blot分析：參照文獻(xiàn)［3］，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離變性核蛋白100μg，轉(zhuǎn)膜（生物素化的蛋白Ladder同時(shí)電泳轉(zhuǎn)膜，為評(píng)估待測(cè)蛋白的分子量提供標(biāo)準(zhǔn)），抗體孵育顯色后分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.5RT-PCR檢測(cè)：①RNA的提取及cDNA合成：采用Trizol法提取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法合成cDNA。②PCR擴(kuò)增TOPOIIα：上游：5’-TGC CTGTTT AGT CGC TTT C-3’，下游：5’-GGG TCC CTTTGT TTG TTG T-3’，產(chǎn)物349 bp，引物與GenBank基因序列核對(duì)無(wú)誤，采用β2微球蛋白(上游：5’-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’，下游：5’-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3’，產(chǎn)物115 bp)作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，TOPOIIα：95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，美國(guó)ST公司AlphaImager TM1200型讀膠儀讀取擴(kuò)增條帶的光密度值進(jìn)行分析，以目標(biāo)基因與β2微球蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值的比值計(jì)算表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.6染色質(zhì)免疫沉淀分析法：ChIP檢測(cè)用ChIP分析試劑盒，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞用終濃度為1%的甲酰胺固定10 min，使轉(zhuǎn)錄因子與DNA交聯(lián)，細(xì)胞裂解液破膜后，用超聲將DNA打碎成250～1000 bp大小（此處提取的DNA片段命名為input DNA）。用特異性抗體（抗乙?；M蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體）沉淀DNA-蛋白復(fù)合物，用蛋白A瓊脂吸附復(fù)合物，經(jīng)洗去非特異性吸附后，解交聯(lián)，沉淀的DNA片段-20 ℃保存?zhèn)溆茫ù薉NA片段命名為ChIPed DNA）。用IgG抗體作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HQ對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα含量的影響HQ處理后，TOPOIIα含量較對(duì)照組明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)圖1、表1。

表1兩組TOPOIIα蛋白含量、TOPOIIαmRNA含量的比較（±s，n＝3）

表1兩組TOPOIIα蛋白含量、TOPOIIαmRNA含量的比較（±s，n＝3）

與對(duì)照組比：**P<0.01

骨髓單個(gè)核細(xì)胞對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t TOPOIIα蛋白0.983±0.029 0.017±0.029** 41.012 TOPOIIαmRNA 2.833±0.208 0.610±0.128** 15.770

圖1HQ對(duì)正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα含量的影響(TOPOIIα170 kDa)

2.2 HQ對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIαmRNA水平的影響氫醌處理后，TOPOIIα mRNA水平較對(duì)照組明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)圖2、表1。

圖2HQ對(duì)正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIαmRNA水平的影響(TOPOIIα 349 bp，β2-MG 115 bp)

表2HQ對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白乙?；⒓谆降挠绊懀ā纒）

表2HQ對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白乙?；⒓谆降挠绊懀ā纒）

與對(duì)照組比：*P<0.05，**P<0.01

骨髓單個(gè)核細(xì)胞對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t TOPOIIα啟動(dòng)子水水平(n＝5) AceH4 1.198±0.056 0.324±0.229** 4.712 AceH3 1.253±0.045 1.177±0.025 2.570 MethH3K4 1.013±0.035 0.54±0.062** 11.443 MethH3K9 0.917±0.015 0.960±0.010* -4.111

2.3 HQ對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白乙酰化、甲基化水平的影響HQ處理后，與乙?；M蛋白H4、甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的TOPOIIα啟動(dòng)子水平明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01）；與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的TOPOIIα啟動(dòng)子水平輕度升高，差異有顯著性（P＜0.05）；而與乙?；M蛋白H3結(jié)合的TOPOIIα啟動(dòng)子水平無(wú)明顯改變（P＞0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

近年來(lái)，苯所致造血毒性已得到廣泛重視，但其毒性機(jī)制仍遠(yuǎn)未闡明。自1996年Frantz等首次提出，苯的活性代謝產(chǎn)物抑制TOPOII的活性開(kāi)始，拓?fù)洚悩?gòu)酶在苯致造血毒性中的作用日漸明確。目前認(rèn)為，苯的代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致拓?fù)洚悩?gòu)酶功能失常，繼而導(dǎo)致DNA損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或畸變，最終導(dǎo)致白血病的生成[1-2]。

國(guó)內(nèi)外的研究者就苯的代謝產(chǎn)物對(duì)拓TOPOIIα功能的抑制進(jìn)行了相關(guān)的研究，但主要停留在分離純化的人拓?fù)洚悩?gòu)酶系統(tǒng)、白血病細(xì)胞株、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4-6]等階段。苯的代謝產(chǎn)物能否抑制人骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα的功能，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下HQ能誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡，HQ誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡的最佳濃度為50 μmol/L，作用10 h時(shí)達(dá)高峰[7]，我們觀(guān)察正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞50μmol/L HQ培養(yǎng)10 h細(xì)胞凋亡最明顯時(shí)TOPOIIα表達(dá)的改變。發(fā)現(xiàn)正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞50μmol/L HQ處理10 h后，TOPOII α含量及mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降，進(jìn)一步的臨床苯中毒病人也證實(shí)了這一點(diǎn)（數(shù)據(jù)另文發(fā)表），證明HQ能抑制造血細(xì)胞TOPOIIα的表達(dá)，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的在分離純化的人拓?fù)洚悩?gòu)酶系統(tǒng)[4]、老鼠原粒細(xì)胞株32D.3（G）HQ處理后[5]及老鼠體外實(shí)驗(yàn)觸苯后[6]TOPOIIα的表達(dá)變化相符，且更真實(shí)完整地反映苯損傷后機(jī)體的變化。

表觀(guān)遺傳機(jī)制的改變導(dǎo)致的基因失活是近年來(lái)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，主要包括組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、DNA甲基化和染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中其他成分的修飾。這些修飾改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失常，最終致癌。有研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)TOPOIIα啟動(dòng)子的誘導(dǎo)與組蛋白H4乙酰化緊密相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)特選用組蛋白特異性抗體，結(jié)合ChIP技術(shù)來(lái)研究TOPOIIα含量變化與組蛋白乙酰化水平改變的關(guān)系，探討其可能的機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)：苯代謝物HQ接觸后人骨髓單個(gè)核細(xì)胞TOPOIIα表達(dá)降低伴隨著TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H4乙?；降慕档汀６M蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，去乙?；Ｒ?jiàn)基因轉(zhuǎn)錄沉默[9]。因此，TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H4乙?；浇档褪荰OPOIIα表達(dá)降低的機(jī)制之一。組蛋白除了H4常會(huì)發(fā)生乙?；揎椡?，H3也是常見(jiàn)的修飾位點(diǎn)，組蛋白H3的翻譯后修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)控及染色質(zhì)稠密中發(fā)揮了重要的作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，TOPOIIα表達(dá)降低不伴有TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H3乙?；降母淖?，提示TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H3乙酰化水平降低可能不參與TOPOIIα表達(dá)的降低。組蛋白H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)[11]，而組蛋白H3K9甲基化常見(jiàn)基因轉(zhuǎn)錄沉默[12]。本研究結(jié)果顯示，人骨髓單個(gè)核細(xì)胞苯及其代謝物接觸后TOPOIIα表達(dá)降低伴隨著TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H3K4甲基化水平的減低、H3K9甲基化水平的升高。說(shuō)明TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H3K4甲基化水平的減低、H3K9甲基化水平的升高亦可能是TOPOIIα表達(dá)降低的機(jī)制之一。

綜上所述，人骨髓單個(gè)核細(xì)胞HQ處理后存在著TOPOIIα含量、mRNA表達(dá)水平的下降，而TOPOIIα啟動(dòng)子組蛋白H4乙酰化、組蛋白H3K4甲基化水平的減低、H3K9甲基化水平升高可能是TOPOIIα表達(dá)降低的機(jī)制之一。下一步，我們將在已成功建立的苯誘發(fā)小鼠再生障礙性貧血模型[13]基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)TOPOIIα的影響，進(jìn)一步證實(shí)組蛋白化學(xué)修飾在苯中毒中的作用，期望研發(fā)出苯中毒的特效解毒藥物。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of hydroquinone on expression of topoisomerase enzyme Ⅱαin human bone marrow mononuclear cells and the possible mechanism

SHI Yifen，YU Kang，CHEN Yi，REN Xingzhou，BI Laixi， Qian Honglan.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Objective: To observe the effects of hydroquinone(HQ)on the expression of topoisomerase Ⅱα(TOPOⅡα)in human bone marrow mononuclear cells，and to explore the possible regulatory mechanism of TOPOⅡαinvolving in the toxicity of HQ to hematopoietic cells. Methods: Human bone marrow mononuclear cells was exposed to 50μmol/L HQ for 10 h(used the cells which were exposed to sterile distilled water for 10 h as control). The expression levels of TOPOⅡα mRNA and protein were detected with RT-PCR technique and Western blot method，respectively. The Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)assay was carried out to study the possible mechanism of TOPOⅡα expression changes. Results:The protein and mRNA expression of TOPOⅡα after treated with HQ for 10 h were significantly lower than that in the control(P＜0.01）. The decreased content of TOPOⅡα was associated with descended level of histone H4 acetylation(P＜0.01），H3K4 methylation(P＜0.01）and heightened level of H3K9 methylation of TOPOⅡα promoter(P<0.05)than that in the control with the significant difference，but without accompanied with descented level of histone H3 acetylation（P＞0.05）. Conclusion:HQ can repress the expression of TOPOⅡα in human bone marrow mononuclearcells. The changes of histone chemical modification play definite important role in the benezen’s hematopoietic toxicity.

hydroquinone；TopoisomeraseⅡα；histone acetylation；histone methylation；Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

book=3,ebook=3

R135.1+2

A

1000-2138 (2010)02-0164-04

2009-05-20

溫州醫(yī)學(xué)院重大科研課題B類(lèi)（2005yxy116）。

施益芬（1981-），女，浙江溫州人，碩士。

俞康，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email: yukang62@126.com。