高書鋒，任 杰，張德元，陳 薇，許麗娟，魏小武

（湖南省微生物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

近年研究表明，益生菌可改善動(dòng)物腸道菌群的平衡，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，提高動(dòng)物消化功能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等益生作用，其作為綠色飼料添加劑取代抗生素已得到廣泛應(yīng)用[1]。

凝結(jié)芽孢桿菌既產(chǎn)乳酸又產(chǎn)芽孢，具有一般乳酸菌維持腸道微生態(tài)平衡，刺激免疫，提高動(dòng)物消化功能等益生作用，還具有芽孢菌抗胃酸、抗膽堿、抗熱和抗干燥等抗逆能力[2]。李國(guó)建[3]研究證實(shí)生長(zhǎng)肥育豬飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌制劑可顯著提高豬的平均日增重，降低飼料成本；Adami and Cavazzoni[4]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)仔豬糞中的微生物區(qū)系有明顯的影響，且這種益生菌有利于改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能。凝結(jié)芽孢桿菌突出的飼喂功能和良好的加工性能，使其必將成為飼料添加劑行業(yè)中不可替代的重要成員。影響益生菌效果的因素有：菌種、活菌含量、使用階段、制劑的穩(wěn)定性等，其中提高活菌數(shù)是發(fā)酵生產(chǎn)微生態(tài)制劑的關(guān)鍵技術(shù)，也是微生態(tài)制劑發(fā)揮生物學(xué)作用的重要因素[5]。筆者實(shí)驗(yàn)室篩選出一株畜禽用益生菌，經(jīng)鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌，本研究以提高活菌數(shù)為目標(biāo)，初步探討凝結(jié)芽孢桿菌搖瓶液體發(fā)酵條件，優(yōu)化發(fā)酵工藝，為進(jìn)一步的發(fā)酵罐生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）菌種，由湖南省微生物研究所實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH=7.0～7.2；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH=7.0～7.2；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 5 g/L、蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 （1）菌種活化：將凝結(jié)芽孢桿菌菌種活化后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，備用。（2）種子液制備：取3環(huán)活化菌種，接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，35℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)方法 活菌總數(shù)測(cè)定：采用梯度稀釋后，傾注平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化 （1）培養(yǎng)溫度選擇 ：按1%的接種量將種齡為24 h的凝結(jié)芽孢桿菌種子液分別轉(zhuǎn)接到裝液量為20%、pH=7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別置 30、35、40、45℃搖床發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為 200 r/min，培養(yǎng)48 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳發(fā)酵溫度。

（2）培養(yǎng)轉(zhuǎn)速選擇：按1%的接種量將種齡為24 h的凝結(jié)芽孢桿菌種子液分別轉(zhuǎn)接到裝液量為20%、pH=7.0 的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別置 140、180、220、260 r/min搖床發(fā)酵，溫度35℃，發(fā)酵48 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

（3）裝液量選擇：按1%的接種量將種齡為24 h的凝結(jié)芽孢桿菌種子液分別轉(zhuǎn)接到裝液量分別為5%、10%、15%、20%，初始pH=7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵48 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳裝液量。

（4）接種量選擇：分別以1%、3%、5%、7%和10%的接種量將種齡為24 h的凝結(jié)芽孢桿菌種子液接入初始裝液量為10%、pH值為7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵48 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳接種量。

（5）初始pH值選擇：分別以3%的接種量將種齡為24h的凝結(jié)芽孢桿菌種子液接入初始pH分別為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和 8.5，裝液量為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵48 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳初始pH。

（6）發(fā)酵時(shí)間選擇：分別以3%的接種量將種齡為24h的凝結(jié)芽孢桿菌種子液接入初始pH為7.0、裝液量為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，置35℃、220 r/min 搖床發(fā)酵，發(fā)酵 18、24、30、36、42、48 h 后，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4 培養(yǎng)基單因素篩選 （1）碳源篩選：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的碳含量計(jì)算碳濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源分別用其他碳源替換，接種量為3%，裝液量為10%，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳碳源。

（2）氮源篩選：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨的氮含量計(jì)算氮濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源分別用其他氮源替換，接種量為3%，裝液量為10%，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳氮源。

（3）磷源篩選：以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽的磷含量計(jì)算磷濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷源分別用 KH2PO4、1/2 KH2PO4+1/2 K2HPO4和 K2HPO4替換，接種量為3%，裝液量為10%，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳磷源。

（4）無(wú)機(jī)鹽篩選：去掉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽，添加0.002 mol/L的不同種類的無(wú)機(jī)鹽，以不加任何無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，接種量為3%，裝液量為10%，置35℃、220 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定，確定最佳無(wú)機(jī)鹽類。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)凝結(jié)芽孢子桿菌發(fā)酵條件單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出最佳的碳源、氮源、磷源（葡萄糖、酵母膏和磷酸二氫鉀）及2種對(duì)發(fā)酵水平影響較大的無(wú)機(jī)鹽類（MnSO4·H2O和 MgSO4·7H2O），設(shè)計(jì)五因素四水平正交試驗(yàn)，選用L16（45）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（表1）。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì) （g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響由圖1可知：不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平有一定影響，發(fā)酵溫度為30℃和35℃時(shí)，發(fā)酵液的活菌數(shù)較高，分別為 7.8×108cfu/mL 和 8.6×108cfu/mL，40℃和45℃發(fā)酵水平較低，分別為3.7×108cfu/mL和2.7×108cfu/mL，初步確定最佳發(fā)酵溫度為35℃。

2.1.2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響由圖2可知：不同轉(zhuǎn)速對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平有一定影響，其中轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，發(fā)酵液的活菌數(shù)最高，為 12.4×108cfu/mL，轉(zhuǎn)速為 140、180、260 r/min時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)較低，分別為7.8×108、8.3×108、6.5×108cfu/mL，初步確定最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速為220 r/min。

圖1 不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

圖2 不同轉(zhuǎn)速對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.1.3 不同裝液量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響 由圖3可知：不同裝液量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平有一定的影響，裝液量為5%和10%時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)相當(dāng)，分別為8.8×108cfu/mL和8.5×108cfu/mL；裝液量為15%和20%時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)分別為6×108cfu/mL和5.8×108cfu/mL。從一定程度上說(shuō)明，溶氧量越高，發(fā)酵水平越高。鑒于裝液量太少，發(fā)酵液有一定蒸發(fā)量，易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，因此確定最佳裝液量為10%。

圖3 不同裝液量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.1.4 不同接種量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響 由圖4可知：不同接種量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平影響較大，接種量為1%、3%、5%、7%、10%時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)分別為 12×108，23×108，18×108，8×108、10×108cfu/mL，接種量對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平起著關(guān)鍵作用，過(guò)高或過(guò)低的接種量均不利于菌體的生長(zhǎng)，因此，初步確定凝結(jié)芽孢桿菌最佳接種量為3%。

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵不同接種量篩選結(jié)果

2.1.5 不同初始pH對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響 由圖5可知：不同初始pH對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平影響較大，發(fā)酵液初始pH=7.0時(shí)，發(fā)酵液的活菌數(shù)最高，為20.2×108cfu/mL，其次為pH=6.5和pH=7.5時(shí)，活菌數(shù)分別為15.1×108cfu/mL和12.7×108cfu/mL，pH=5.0和 pH=8.5時(shí)，活菌數(shù)最低，分別為 1.3×108cfu/mL 和 2.0×108cfu/mL。因此，初步確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳初始pH值為：pH=7.0。

圖5 凝結(jié)芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵不同初始pH篩選結(jié)果

2.1.6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響 由圖6可知：不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平也影響較大，發(fā)酵時(shí)間為42 h時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為22.1×108cfu/mL，發(fā)酵時(shí)間為36 h和48 h時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)較高，為15.0×108cfu/mL和16.3×108cfu/mL，其他發(fā)酵時(shí)間的活菌數(shù)較低，初步確定最佳發(fā)酵時(shí)間為42 h。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響由圖7可知，葡萄糖作為碳源時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為26.4×108cfu/mL，淀粉作為碳源時(shí)，活菌數(shù)較高，為21.2×108cfu/mL，其他碳源發(fā)酵水平較低。

圖7 不同碳源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.2.2 不同氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響由圖8可知，有機(jī)氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵水平起關(guān)鍵作用。以酵母膏作為氮源時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為20.0×108cfu/mL，其他有機(jī)氮源，發(fā)酵水平較高，而硝酸鉀和硫酸銨兩種無(wú)機(jī)氮源，發(fā)酵水平最低，活菌數(shù)分別為1.0×108cfu/mL 和0.4×108cfu/mL。

圖8 不同氮源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.2.3 不同磷源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響由圖9可知，以KH2PO4作為磷源時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為 22.0×108cfu/mL；K2HPO4作為磷源時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)為12.0×108cfu/mL；二者合用時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)最低，為7.0×108cfu/mL。

圖9 不同磷源對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.2.4 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響 由圖10可知，分別添加硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵和硝酸鉀4種無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵水平優(yōu)于CK，發(fā)酵液活菌數(shù)分別為 12.1×108、10.6×108、9.4×108、8.6×108cfu/mL，而其他無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵水平低于CK。

圖10 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，從表2的極差分析可以看出影響凝結(jié)芽孢子桿菌發(fā)酵水平主次因素關(guān)系為：B>E>C>A>D （酵母膏>MgSO4·7H2O>KH2PO4>葡萄糖>MnSO4·H2O），因素間最佳水平組合為A2B4C3D2E1，凝結(jié)芽孢桿菌的最佳發(fā)酵工藝條件為：葡萄糖8.0 g/L，酵母膏12.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，MnSO4·H2O 0.18 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3，從表3可以看出，F(xiàn)酵母膏=13.554＞3，3 ）=9.28，說(shuō)明酵母膏的作用達(dá)到顯著水平，因此，在發(fā)酵過(guò)程中要嚴(yán)格控制酵母膏的用量，其他因素的作用沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化采用的L16（45）正交表的安排以及直觀分析結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用漸進(jìn)法優(yōu)化發(fā)酵條件，每確定一項(xiàng)，就在下一目標(biāo)篩選中應(yīng)用，這樣使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確[6]。在優(yōu)化磷源實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)酵水平有所下降，原因可能與斜面菌種活化生長(zhǎng)狀況，種子液非同批次培養(yǎng)等情況有關(guān)。鑒于這些原因，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了種子液和菌體濃度的線性關(guān)系[7]，接種前測(cè)定種子液，轉(zhuǎn)換成菌體濃度后，再確定接種量。

通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成的優(yōu)化，初步確定了最佳發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成，最佳發(fā)酵條件：溫度35℃、轉(zhuǎn)速220 r/min、裝液量10%、接種量3%、初始pH=7.0、發(fā)酵時(shí)間42 h；最佳培養(yǎng)基組成：葡萄糖8.0 g/L，酵母膏12.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，MnSO4·H2O 0.18 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)38×108cfu/mL。

[1]李旋亮，吳長(zhǎng)德，李建濤.微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用[J].添加劑世界，2009，（7）：23-26.

[2]崔東良，佟建明，王云山，等.凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)基初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：73-75.

[3]李國(guó)建.凝結(jié)芽孢桿菌替代抗生素對(duì)豬生產(chǎn)性能的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，（10）：72-74.

[4]Adami A.，Cavazzoni V.Occurrence of selected bacterial groups in the faeces of piglets fed with Bacillus coagulans as probiotic[J].J.Basic Microbiol，1999，（39）：3-9.

[5]秦 艷，李衛(wèi)芬，雷 劍，等.凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20（6）：471-474.

[6]王 振，王 靜，趙廷昌，等.煙草青枯病拮抗細(xì)菌芽孢桿菌AR03菌株搖瓶發(fā)酵條件的篩選 [J].中國(guó)生物防治，2006，10（22）：119-123.

[7]朱艷靜，李 宇.測(cè)定菌體濃度的簡(jiǎn)便方法 [J].工業(yè)微生物，2006，4（36）：47-49.