王小紅

（南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南通 226006）

生物技術(shù)的迅速發(fā)展為加快玉米育種進(jìn)程開(kāi)辟了新途徑，玉米體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷取得進(jìn)展。利用玉米不同器官作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究顯得格外重要。研究建立有效的組織培養(yǎng)系統(tǒng)，從中獲得大量再生植株是玉米育種工作的首要前提。自1975年Green首次從玉米未成熟胚培養(yǎng)出愈傷組織，并成功地獲得了再生植株以來(lái)，玉米幼胚培養(yǎng)技術(shù)有了快速發(fā)展。雖現(xiàn)在幾乎能從玉米各個(gè)部位誘導(dǎo)出愈傷組織，但幼胚是最易誘導(dǎo)也是使用最多的外植體。誘導(dǎo)玉米幼胚產(chǎn)生胚性愈傷組織及胚性愈傷組織分化受諸多因素的影響，包括基因型、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件、幼胚大小等。筆者選用抗性好、適宜本地種植的玉米自交系幼胚進(jìn)行了外植體的愈傷組織誘導(dǎo)研究，旨在建立具有胚性的愈傷組織培養(yǎng)體系，為玉米遺傳轉(zhuǎn)化提供受體材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料為玉米自交系515、齊319、魯原 341、502，海南種植。

1.1.2 試劑與儀器 抗生素、生長(zhǎng)素、封口膜等購(gòu)于上海生工。烘箱、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、氣候箱等由南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0.5 g/L Pro、40 g/L 蔗糖、0～2.5 mg/L 2，4-D 、0.5 mg/L氨基苯甲酸、0.5 mg/L泛酸鈣、0.25 mg/L核黃素；（2）MS繼代培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L 、0.5 g/L Pro、30 g/L 蔗糖；（3）分化培養(yǎng)基：MS 培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖、0～2 mg/L 6-BA ；（4）生根培養(yǎng)基：N 6 培養(yǎng)基+20～30 g/L 冰糖、5 g/L 活性炭、1 mg/L 6-BA 。

1.2 方法

1.2.1 幼胚的預(yù)處理 取授粉后11～13 d的玉米果穗，剝?nèi)プ钔鈨蓪影~。用70%乙醇噴灑苞葉表面，然后剝?nèi)訉影~，當(dāng)剩最后一層時(shí)，再用70%乙醇噴灑苞葉表面，立刻將果穗轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)。去掉苞葉和花絲，用解剖刀削去子粒頂部2/3胚乳，用鑷子從中上部挑出幼胚（幼胚大小最適0.8～2.0 mm）。盾片朝上放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，避光、27℃下誘導(dǎo)出愈傷組織。

1.2.2 玉米愈傷的繼代培養(yǎng) 誘導(dǎo)出的長(zhǎng)勢(shì)好的愈傷組織夾成2～3 mm大小的塊，在繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，約10～12 d繼代一次，進(jìn)行愈傷組織的增殖。培養(yǎng)溫度為28℃，光照10～12 h/d，光照強(qiáng)度800～1 000 Lx，日光燈照明。

1.2.3 愈傷組織再分化及植株的再生 將抗性的愈傷挑入分化培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，再生植株。當(dāng)再生苗在三角瓶中長(zhǎng)到6～9 cm高時(shí)，將其移到小的花盆中(下層為滅菌的壤土，上層為蛭石)，每天澆l/10 MS營(yíng)養(yǎng)液，并套袋保濕，在大棚中培養(yǎng)10 d左右，移栽到土壤中。

1.2.4 影響愈傷組織誘導(dǎo)的各因素 （1）胚齡和基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響：分別取授粉后8、9、10、11、12、13 d(海南地區(qū)夏播)的玉米幼胚，幼胚長(zhǎng)度約在1～3 mm左右，基因型分別為齊319、515、魯原 341、502，在加有 0.5 m g/L 2，4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在20 d左右統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，并對(duì)胚齡和基因型兩因素進(jìn)行隨機(jī)試驗(yàn)方差分析。（2）2，4-D濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響：取授粉10 d的齊319、魯原34的玉米幼胚，在 2，4-D 濃度為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織塊數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素

2.1.1 胚齡對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 如表1所示，胚齡9 d的魯原341胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可以達(dá)到98.5%，其他基因型授粉10 d左右的幼胚最高。13 d的幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率很低，最高的齊319也只有76.8%。從表1可以看出，10 d胚齡的幼胚誘導(dǎo)率最高，平均達(dá)到88.09%，13 d的最低，平均只有65.90%。胚齡對(duì)于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率差異比較顯著。從技術(shù)的可操作性和培養(yǎng)性狀來(lái)講，10 d左右的幼胚一般在1.2～1.5 mm左右，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高，幼胚容易從雌穗上剝離，實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)。胚齡較大的幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上容易萌發(fā)，誘導(dǎo)出的愈傷組織發(fā)粘、胚性差、不易繼代。

表1 不同基因型玉米幼胚不同生長(zhǎng)天數(shù)下的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率 （%）

2.1.2 基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 從表1的數(shù)據(jù)和分析中可以看出齊319的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率平均最高，達(dá)到87.08%，502的最低，只有61.44%。其中502誘導(dǎo)出的愈傷組織大部分發(fā)粘，H型胚性愈傷組織少，不易繼代培養(yǎng)；齊319與魯原341誘導(dǎo)的H型愈傷組織多，松脆，淡黃色，胚性好。說(shuō)明不同的基因型在相同2，4-D濃度的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著差異，由此看出基因型是影響玉米遺傳轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要因素。

2.1.3 2，4-D濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效，在組織培養(yǎng)中一般用其作為培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)激素。培養(yǎng)基中2，4-D的濃度對(duì)玉米愈傷組織的誘導(dǎo)影響極大。如表2所示，齊319在1.0 m濃度上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到97.8%，而魯原341在0.5 mg/L上誘導(dǎo)率最高，達(dá)到98.5%。可見(jiàn)2，4-D濃度對(duì)玉米幼胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率有很大影響，而不同基因型的最大誘導(dǎo)率所需的2，4-D濃度也不相同。為防止2，4-D濃度過(guò)高影響玉米愈傷組織的分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2，4-D濃度最高不超過(guò)2 mg/L。

表2 2，4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 （%）

2.2 影響愈傷組織繼代的因素

2.2.1 繼代時(shí)間的影響 愈傷組織在繼代的前2～3 d，處于靜止生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)緩慢，4～5 d后愈傷組織明顯膨大，周緣開(kāi)始長(zhǎng)出米粒狀的新愈傷組織，此時(shí)生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10～12 d以后，愈傷組織生長(zhǎng)開(kāi)始緩慢，進(jìn)入延遲生長(zhǎng)期，此時(shí)要進(jìn)行繼代培養(yǎng)。否則愈傷組織容易失去胚性，不易分化成苗。繼代時(shí)間的長(zhǎng)短是愈傷組織能否長(zhǎng)期保持胚性的關(guān)鍵因素之一，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)行繼代，能夠長(zhǎng)時(shí)間保持愈傷組織的胚性。繼代時(shí)愈傷組織夾成2～3 mm的小塊轉(zhuǎn)移到新的繼代培養(yǎng)基上，夾取顏色鮮黃、較脆的胚性愈傷組織進(jìn)行繼代較好。

2.2.2 生長(zhǎng)素濃度對(duì)繼代的影響 繼代培養(yǎng)基的2，4-D濃度一般為1 mg/L，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，且可以長(zhǎng)期保持胚性。2，4-D濃度過(guò)高會(huì)使愈傷組織受到傷害，同時(shí)也可以增加無(wú)性系變異2，4-D濃度過(guò)低愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)勢(shì)不好，不利于繼代。

2.3 影響愈傷組織再生的因素

2.3.1 AgNO3對(duì)玉米再生率的影響 試驗(yàn)表明，在培養(yǎng)基上添加8 mg/L AgNO3可以明顯提高玉米再生率。當(dāng)AgNO3濃度高于20 mg/L時(shí)，愈傷組織多數(shù)出現(xiàn)只長(zhǎng)根，不長(zhǎng)芽現(xiàn)象，或者只是產(chǎn)生一些胚狀根，雖然有綠點(diǎn)，但是無(wú)法形成真正的綠苗。

2.3.2 MET對(duì)玉米再生苗的影響 由于三角瓶中濕度大，光線弱，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富，玉米再生苗在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快、莖稈細(xì)、節(jié)間長(zhǎng)、葉片發(fā)黃、植株弱小、根系不發(fā)達(dá)、移栽后不易成活。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加2 mg/L MET可以有效抑制玉米苗徒長(zhǎng)，苗粗壯健康，節(jié)間縮短，葉色發(fā)綠，根系發(fā)達(dá)，移栽后容易成活。

3 結(jié)論與討論

（1）在培養(yǎng)基的選擇上，主要采用MS和N6培養(yǎng)基，二者對(duì)于不同品種和品系玉米愈傷組織的植株再生影響不同。對(duì)于誘導(dǎo)產(chǎn)生出胚性愈傷組織，MS比N6效果好，若由幼胚直接再生植株，則N6培養(yǎng)基效果更好，MS與N6的主要區(qū)別在于氮源的形式不同。此外激素的選擇也影響愈傷組織的生成，2，4-D是影響組織脫分化的關(guān)鍵因素，較高濃度的2，4-D誘導(dǎo)外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織，降低或不加2，4-D愈傷組織才能分化出完整的胚狀體，并再生出小植株。在誘導(dǎo)愈傷組織和繼代過(guò)程中，培養(yǎng)物有三種類型：Ⅰ型：結(jié)構(gòu)緊密，不易分開(kāi)，這種愈傷組織很容易分化成芽和根或胚狀體，但不易繼代培養(yǎng)。Ⅱ型：結(jié)構(gòu)松軟，白色透明，很容易繼代培養(yǎng)，但喪失了分化能力。Ⅲ型：介于Ⅰ型和Ⅱ型之間，具有明顯的顆粒狀結(jié)構(gòu)，白色或淺黃色，具有分化胚狀體的能力，而且又能繼代培養(yǎng)。因此，把第三種類型篩選出來(lái)，才能使繼代培養(yǎng)的愈傷組織保持它的分化能力。

（2）根據(jù)玉米愈傷組織的類型，可以挑選合適的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)。愈傷組織分化是不整齊的，這是因?yàn)樵谟鷤M織繼代中并沒(méi)有進(jìn)行同步培養(yǎng)有關(guān)。分化率的高低與基因型和培養(yǎng)基有很大的關(guān)系，而在繼代中表現(xiàn)好的自交系其分化率也相對(duì)較高。但不同的基因型材料還應(yīng)進(jìn)一步作不同培養(yǎng)基的試驗(yàn)，以提高愈傷組織的分化率。所有材料在繼代過(guò)程中都有分化現(xiàn)象出現(xiàn)，有的出現(xiàn)綠點(diǎn)，應(yīng)視愈傷組織生長(zhǎng)情況及時(shí)調(diào)整激素濃度及比例，如分化明顯，根毛及芽較多應(yīng)提高2，4-D濃度，降KT或BA濃度，反之則相反。但2，4-D濃度不宜超過(guò)4 mg PL，也不能在高濃度2，4-D條件下繼代時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一旦受到此影響，材料的分化能力就很難恢復(fù)。

（3）本實(shí)驗(yàn)所用的4個(gè)材料均能誘導(dǎo)出愈傷組織，表明玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)具有普遍性，但各個(gè)材料問(wèn)的誘導(dǎo)率差別較大，實(shí)驗(yàn)表明基因型對(duì)玉米愈傷組織的產(chǎn)生有著重要影響。Spencer等的研究發(fā)現(xiàn)，玉米的基因型、幼胚大小及植株的發(fā)育狀態(tài)是影響玉米幼胚培養(yǎng)及植株再生的重要因素，其中玉米的基因型影響特別大。實(shí)驗(yàn)也表明濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效，這與王雷等在誘導(dǎo)玉米愈傷組織時(shí)的發(fā)現(xiàn)一致。中國(guó)科學(xué)院上海植生所黃璐等認(rèn)為，2，4-D雖然可以起到誘導(dǎo)的作用，但其對(duì)外植體及愈傷組織的傷害作用較大，故誘導(dǎo)時(shí)所采取的濃度不易過(guò)大，以減少組織培養(yǎng)中的無(wú)性系變異。

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