宋蓮軍，張 瑩，唐貴芳

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

粉紅女士蘋果是高酸蘋果的代表品種，可滴定酸含量達(dá)到0.65%，是加工蘋果汁的首選。粉紅女士果皮氣孔小，水分散失緩慢，長時間貯藏不皺皮，果面新鮮，爛果少，貯藏效果極佳。出汁率高，在采收期出汁率達(dá)80.4%，比富士高18.4%，貯藏50 d后，出汁率比澳洲青蘋高8.7%。研究表明，粉紅女士是一個綜合品質(zhì)優(yōu)良、耐貯藏的鮮食、果汁加工兼用型蘋果新品種[1－3]。然而，在蘋果汁生產(chǎn)過程中，新鮮蘋果經(jīng)過破碎壓榨后，很容易發(fā)生酶促褐變，這不僅影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)，而且其營養(yǎng)品質(zhì)也隨之發(fā)生劣變，嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的銷售和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，酶促褐變已經(jīng)成為制約我國果汁產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“瓶頸”。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡稱PPO）參與蘋果的酶促褐變早已得到證實(shí)，蘋果的PPO pH值在4.0～8.0時有較高的穩(wěn)定性，最適pH值在6.2～6.6之間，最適溫度在20～30℃之間，其特性因蘋果品種的不同而略有不同[4-7]。人們也一直在尋找合適的、能用于抑制蘋果多酚氧化酶活性的防褐變劑，但仍然沒有找到一種安全高效、成本低廉、使用簡單且具有普遍應(yīng)用性的抑制劑。植酸對果蔬汁也有護(hù)色效果，目前國內(nèi)有關(guān)植酸在蘋果汁生產(chǎn)中的應(yīng)用研究較少[8]。H O zolu和A Bayindirli研究認(rèn)為肉桂酸的防褐變作用僅次于L-半胱氨酸，但是不能達(dá)到長期防止酶促褐變的目的[9]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)洋蔥汁[10]、蛋白酶[11]和葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶系統(tǒng)[12]可抑制酶促褐變，但由于口味的改變、成本高、添加量不確定等原因而沒有得到廣泛應(yīng)用。

目前，國內(nèi)對于粉紅女士蘋果加工成的鮮榨蘋果汁的防褐變效果研究和蘋果汁貯藏過程中防褐變的研究幾乎沒有報道。本試驗(yàn)以粉紅女士蘋果為試驗(yàn)材料，研究植酸、NaCl和EDTA-Na2對粉紅女士PPO的效應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上研究抑制劑及其組合在鮮榨蘋果汁及蘋果汁貯藏過程中防褐變的效果，以期為粉紅女士的加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粉紅女士蘋果，由陜西省果樹研究所提供。貯存于4℃下備用。

1.2 儀器設(shè)備

Neofuge 23R臺式冷凍離心機(jī)（香港力康發(fā)展有限公司）、WB-200IXA全自動測色色差計(jì)（北京康光儀器有限公司）；UV-2000紫外分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；R201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；HY-S回旋式振蕩器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）。

1.3 抑制率的測定

抑制率反映抑制劑對PPO的抑制程度，抑制率越高說明防褐變劑對PPO的抑制程度越大。

式中：A0——對照實(shí)驗(yàn)的吸光值；A——添加防褐變劑的吸光值

1.4 褐變率的測定

取3 mL蘋果汁放入比色槽中（控制25℃），用全自動測色色差計(jì)通過反射法間隔一定時間測色[13]（以L值，a*值和b*值表示），其中L值越大則果汁越亮，反之越暗。A值越大則果汁越紅，反之果汁越綠。B值越大則果汁越黃，反之越藍(lán)。測定前儀器用標(biāo)準(zhǔn)白板進(jìn)行校正，標(biāo)準(zhǔn)白板的色值為：L=0.03，a*=0.00，b*=1.29。

式中：L0——蘋果加防褐變劑后制得的果汁的第一個L值；L1——蘋果不加防褐變劑破碎后制的果汁放置t時間后的L值；L2——蘋果加防褐變劑破碎后制的果汁放置t時間后的L值。

1.5 單一抑制劑對PPO活性的影響

取若干試管，按順序加入0.1 mol/L 1 mL鄰苯二酚及不同濃度的抑制劑，混勻，于30℃水浴中溫育10 min后，分別加入酶液1 mL于30℃水浴反應(yīng)1 min。立即加入三氯乙酸混勻，終止反應(yīng)。取出，立即于分光光度計(jì)420 nm處[14]，以蒸餾水為參比，測OD值。根據(jù)不同濃度的抑制劑對PPO的抑制率制作曲線，考察防褐變劑的濃度對PPO活力的影響。

1.6 蘋果汁的自然褐變

將去皮、去核的蘋果果肉200 g切成小塊，料液比按1∶1.25打漿l min，過濾、離心，放入瓶中（未封口）。間隔一定時間（15、30 min、1、2、4、8、12、24 h）測色值，其L值為L0。

1.7 單一抑制劑對鮮榨蘋果汁的防褐變效果

配制一定濃度的抑制劑，然后按照1.6中的料液比制蘋果汁，放置不同時間（同1.6）后測色值，并計(jì)算褐變抑制率。

1.8 復(fù)合抑制劑對鮮榨蘋果汁的防褐變效果

將單一抑制劑按照不同濃度不同組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，然后按照1.6中的料液比制蘋果汁，放置不同時間（同1.6）后測其色值，并計(jì)算褐變抑制率。

1.9 抑制劑對貯藏蘋果汁的防褐變效果

在蘋果汁中添加適量的苯甲酸鈉，常溫下放置，90 d后測定色值，計(jì)算其褐變抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 植酸對PPO的效應(yīng)

2.1.1 植酸對PPO活性的影響 不同濃度的植酸對PPO活性的影響如圖1所示，隨著植酸添加量的增加，PPO的活性逐漸降低。當(dāng)草酸添加量為0.10%時，抑制率達(dá)88.59%；當(dāng)添加量為0.20%時，抑制率達(dá)93.08%；當(dāng)添加量為0.50%抑制率達(dá)97.82%?？梢娭菜峥梢暂^好的抑制PPO活力。選擇0.20%作為植酸抑制PPO活性的濃度。植酸是很強(qiáng)的酸化劑，可以改變環(huán)境的pH而抑制酶活，它還是一種鰲合劑，通過螯合PPO的活性部位銅離子而抑制PPO的活力。

圖1 植酸對PPO活性的影響

2.1.2 植酸對PPO的抑制效應(yīng) 在測活體系中，固定底物（鄰苯二酚）濃度為0.1 mol/L，加入不同濃度的植酸，改變加入的酶量，測定酶促反應(yīng)的活力。以酶活力與加入的酶量作圖，見圖2。得到一組平行直線，隨著植酸濃度的增大，直線的斜率基本不變，但橫軸的截距隨著植酸濃度的增大而增大。說明植酸對PPO的抑制作用屬于不可逆過程，植酸是通過降低有效的酶量導(dǎo)致活力的下降，因此可以作為防褐變抑制劑。

2.2 NaCl對PPO的效應(yīng)

2.2.1 NaCl對PPO活性的影響 不同濃度的NaCl對PPO活性的影響如圖3所示，隨NaCl添加量的增加，PPO的活性逐漸降低，當(dāng)NaCl添加量在0.10%時，抑制率達(dá)63.35%，當(dāng)添加量在0.20%，抑制率達(dá)66.75%，當(dāng)添加量在0.50%抑制率達(dá)70.51%?？梢奛aCl可以抑制PPO活力。由于NaCl是咸味劑，添加量過大會影響蘋果汁風(fēng)味，故選擇0.10%作為NaCl抑制PPO活性的濃度。

圖3 NaCl對PPO活性的影響

2.2.2 NaCl對PPO的抑制效應(yīng) 在測活體系中，固定底物（鄰苯二酚）濃度為0.1 mol/L，加入不同濃度的NaCl，改變加入的酶量，測定酶促反應(yīng)的活力。以加入的酶量為橫坐標(biāo)，以酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見圖4。得到一組通過原點(diǎn)的直線，隨著NaCl濃度的增大，直線的斜率基本不變。說明NaCl對PPO的抑制作用屬于不可逆過程，NaCl是通過降低有效的酶量導(dǎo)致活力的下降，可作為防褐變抑制劑。

圖4 NaCl對PPO抑制機(jī)理的判斷

2.3 EDTA-Na2對PPO的效應(yīng)

2.3.1 EDTA-Na2對PPO活性的影響 不同濃度的EDTA-Na2對PPO活性影響如圖5所示，隨EDTA-Na2添加量的增加，PPO的活性逐漸降低，當(dāng)EDTA-Na2添加量在0.10%時，抑制率達(dá)77.06%，當(dāng)添加量在0.20%，抑制率達(dá)81.07%，當(dāng)添加量在0.50%抑制率達(dá)83.01%?？梢奅DTA-Na2可以較好的抑制PPO活力。選擇0.50%EDTA-Na2作抑制PPO活性的濃度。EDTA-Na2是很強(qiáng)的螯合劑，通過螯合PPO的活性部位銅離子而抑制PPO的活力。

圖5 EDTA-Na2對PPO活性的影響

2.3.2 EDTA-Na2對PPO的抑制效應(yīng) 在測活體系中，固定底物（鄰苯二酚）濃度為0.1 mol/L，加入不同濃度的EDTA-Na2，改變加入的酶量，測定酶促反應(yīng)的活力。以酶促反應(yīng)活力與加入的酶量作圖，得到一組平行直線，見圖6。隨著EDTA-Na2濃度的增大，直線的斜率基本不變，但橫軸的截距隨著EDTA-Na2濃度的增大而增大。說明EDTA-Na2對PPO的抑制作用屬于不可逆過程，EDTA-Na2是通過降低有效的酶量導(dǎo)致活力的下降，可作為防褐變抑制劑。

圖6 EDTA-Na2對PPO抑制機(jī)理的判斷

2.3 蘋果汁的自然褐變

衡量酶促褐變可用色差計(jì)測得的L值，L值越低則酶促褐變越嚴(yán)重。如果在一個時間段內(nèi)值不斷減小，表明酶促褐變一直在發(fā)生。由表1、圖7可知，蘋果破碎后24 h，蘋果汁的L值由15 min時的64.02下降到41.30；同時a*值和b*值都升高了。這表明在自然條件下，蘋果一經(jīng)破碎，其細(xì)胞中的PPO則有機(jī)會與多酚底物接觸，褐變反應(yīng)將發(fā)生且有持續(xù)性，不能以此來衡量其它抑制劑的防褐變效果。

圖7 鮮榨蘋果汁的自然褐變

表1 蘋果汁的自然褐變和添加亞硫酸氫鈉后的防褐變情況

鑒于亞硫酸氫鈉有極好的防止蘋果汁酶促褐變的效果，故在制得的蘋果汁中添加亞硫酸氫鈉，測得蘋果汁色值變化如表1、圖8，L值在15 min～2 h時略有下降，之后就逐漸升高。加亞硫酸氫鈉使果汁L值略有增大的原因，可能是亞硫酸氫鈉還有漂白作用。因此，以后衡量其它抑制劑的防褐變效果時以此為對照。為了排除亞硫酸氫鈉的漂白作用，都以加亞硫酸氫鈉的L0值為對照來計(jì)算其它抑制劑的褐變抑制率。

圖8 添加亞硫酸氫鈉的鮮榨蘋果汁的色值變化

2.4 單一抑制劑的防褐變效果

將鮮榨蘋果汁放置24 h，植酸、NaCl和EDTANa2這3種抑制劑單獨(dú)使用時，測得的防褐變效果有很大的區(qū)別，0.20%植酸的褐變抑制率為85.31%，0.10%NaCl的褐變抑制率為 52.78%，0.50%EDTA-Na2在鮮榨蘋果汁中防褐變效果較差，這3種抑制劑的防褐變能力（褐變抑制率）依次為：0.20%植酸＞0.10%NaCl＞0.50%EDTA-Na2。

2.5 植酸、NaCl和EDTA-Na2組成的復(fù)合抑制劑防褐變正交實(shí)驗(yàn)

將植酸、NaCl和EDTA-Na2組合進(jìn)行鮮榨蘋果汁的防褐變效果正交實(shí)驗(yàn)。按L9（33）設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，見表2。

表2 試驗(yàn)因素水平 （%）

正交試驗(yàn)的結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，在所有正交處理中，8號防褐變效果最好，褐變抑制率92.02%，其次是9號處理，褐變抑制率達(dá)91.52%。通過極差分析可知，復(fù)合抑制劑抑制率的主次因子分別是植酸、NaCl和EDTA-Na2。試驗(yàn)獲得的最優(yōu)組合為0.30%植酸、0.30%NaCl和0.25%EDTANa2，試驗(yàn)測得其褐變抑制率為92.87%。由方差分析表4可知，在顯著性水平α=0.05時，植酸表現(xiàn)為差異顯著性，NaCl和EDTA-Na2沒有顯著性；這表明植酸的影響對于試驗(yàn)結(jié)果較為重要，NaCl和EDTA-Na2的影響不明顯。將制得的蘋果汁貯藏90 d后，抑制褐變率達(dá)87.43%。

表3 復(fù)合抑制劑植酸正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)以粉紅女士蘋果為試驗(yàn)材料，研究了植酸、NaCl和EDTA-Na2制劑在鮮榨蘋果汁及蘋果汁貯藏過程中防褐變的效果，結(jié)果表明：植酸、NaCl、EDTA-Na2對PPO的抑制作用屬于不可逆過程，是通過降低有效的酶量導(dǎo)致PPO活力的下降。這3種抑制劑單獨(dú)使用時，防褐變能力（褐變抑制率）依次為：0.20%植酸＞0.10%NaCl＞0.50%EDTA-Na2。在此基礎(chǔ)上，將這3種抑制劑進(jìn)行復(fù)合，采用正交設(shè)計(jì)的方法確定了復(fù)合抑制劑最優(yōu)組合為0.30%植酸、0.30%NaCl和0.25%EDTA-Na2，試驗(yàn)測得其褐變抑制率為92.87%，將制得的蘋果汁貯藏90 d后，抑制褐變率達(dá)87.43%。

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