季祥，蔡祿

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與生物技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

降解纖維素菌株的篩選和鑒定

季祥，蔡祿

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與生物技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

從腐木、腐根、腐葉、腐草、土樣、牛胃等樣品中篩選獲得11株降解纖維素的菌株，對(duì)其進(jìn)行羧甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基水解圈的測(cè)量，以及羧甲基纖維素鈉酶活力的測(cè)定，獲得1株活性相對(duì)較高的菌株，定名為CJ-3，并對(duì)其進(jìn)行了分類(lèi)學(xué)鑒定初步確定為單胞菌屬，并對(duì)其進(jìn)行了保存。

纖維素酶；菌株篩選；鑒定

農(nóng)作物秸稈作為一種可再生資源，在我國(guó)具有分布廣、數(shù)量大、種類(lèi)多、價(jià)格低廉的特點(diǎn)。如何充分利用這些資源而又使環(huán)境不受污染，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的難題[1]。農(nóng)作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組分組成，由于纖維素特別是木質(zhì)素難以被分解，影響其利用推廣。近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員雖然研究了一些物理、化學(xué)的秸稈利用方法，但都存在著利用不充分、成本高等問(wèn)題[2]。實(shí)踐表明，秸稈的生物法利用是最佳途徑，此法具有降解率高，安全環(huán)保，成本低等優(yōu)點(diǎn)。

纖維素酶在充分利用農(nóng)作物秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物，降解秸稈中的纖維素，開(kāi)發(fā)新能源方面具有巨大的應(yīng)用潛力[3]，目前，用于纖維素酶生產(chǎn)的菌株多為木霉、青霉及曲霉等[4]，但其產(chǎn)生的酶普遍存在活力較低的問(wèn)題。篩選高效纖維素分解菌，確定纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵工藝，是利用秸稈纖維素的關(guān)鍵。本試驗(yàn)從多種土樣中，選出高活性纖維素分解菌株，并對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

城郊農(nóng)村采集不同地點(diǎn)土樣，雜草地土樣，發(fā)霉的腐蘆薈葉，內(nèi)蒙古科技大學(xué)院內(nèi)腐爛的樹(shù)皮、樹(shù)根，屠宰場(chǎng)取牛胃內(nèi)物，等樣品共20份。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基 K2HPO42 g，（NH4）2SO41.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnSO41.7 mg,CoCl22 mg，新華1號(hào)濾紙2 g，pH5.5，121℃滅菌30 min。

1.2.2 分離篩選培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）15 g，NH4NO31g，酵母膏1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，H2O1000 mL，瓊脂2%，pH自然，121℃滅菌30 min。

1.2.3 液體產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）15g，NH4NO31g,MgSO4·7H2O 0.05g，KH2PO41g，H2O1000mL，pH自然，121℃滅菌30min。

1.3 菌株的分離、純化

1.3.1 富集培養(yǎng)過(guò)程 向各樣品瓶中注入50 mL無(wú)菌水，玻璃珠充分振蕩，滅菌紗布過(guò)濾，靜置，取上清液1 mL接種于250 mL裝有增殖培養(yǎng)基50 mL的三角瓶中。搖床210 r/min、28℃培養(yǎng)72 h。之后再將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的新鮮增殖培養(yǎng)基中，反復(fù)培養(yǎng)3次，使菌富集。

1.3.2 菌株的分離篩選 移取富集培養(yǎng)液0.1 mL于CMC-Na培養(yǎng)基上作平板涂布，菌體在28℃瓊脂平板生長(zhǎng)3 d后，每個(gè)平板倒入20 mL剛果紅溶液（1 mg/mL）染色2 h后，加入適量1 mol/L氯化納溶液洗滌，測(cè)量菌體和透明圈直徑。

1.3.3 CMC液體搖瓶篩選 選取透明圈、菌落直徑比值較大菌落及濾紙生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn)。將菌體接種于CMC-Na產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基，28℃、170 r/min搖床培養(yǎng)5 d后測(cè)定羧甲基纖維素鈉酶（CMCase）活力。

1.4 酶活力測(cè)定

1.4.1 酶液制備 取培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液10 mL，在4℃、4 000 r/min條件下離心15 min后，取上清液即為粗酶液。

1.4.2 CMCase酶活力的測(cè)定 取0.5 mL適當(dāng)稀釋酶液，加pH值4.8的醋酸鈉緩沖液，配制1%羧甲基纖維素鈉1.5 mL，于50℃酶解0.5 h，加入2 mL的DNS顯色液于沸水浴5 min，冷卻后在540 nm下測(cè)吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 剛果紅平板篩選

20株菌株在羧甲基纖維素鈉剛果紅瓊脂平板上有11株菌株能夠生長(zhǎng)，表1為纖維素降解菌透明圈反映菌株基本生長(zhǎng)情況。

表1 纖維素降解菌透明圈

從表1看出CJ-3和KD-2生長(zhǎng)情況較好，透明水解圈較大。

2.2 酶活測(cè)定

11株菌株通過(guò)CMC-Na培養(yǎng)基培養(yǎng)后的酶活力測(cè)定見(jiàn)表2

表2 纖維素降解菌CMCase酶活力的測(cè)定

從表2可以看出菌株的變化較大，ZC-1、NW-1和CJ-3的CMCase酶活力相對(duì)高一些。

2.3 菌株鑒定

我們對(duì)CJ-3菌株進(jìn)行了初步的鑒定，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察CJ-3菌株為長(zhǎng)桿狀、產(chǎn)芽孢、有鞭毛、能運(yùn)動(dòng)；菌落表面光滑、不透明，邊緣不整齊呈絲狀；革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，V.P反應(yīng)陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇產(chǎn)酸，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，水解酪素及淀粉，不能利用丙酸鹽，明顯產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，不能分解卵磷脂，沒(méi)有卵磷脂酶活性，在含7%的NaCl培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[5]初步鑒定該菌株為纖維單胞菌屬（Cellulomonas）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從當(dāng)?shù)厝?0份樣品，經(jīng)過(guò)初篩、劃線培養(yǎng)得到11株可降解纖維的菌株，我們對(duì)11株菌株進(jìn)行了水解圈的測(cè)定比較得出CJ-3和KD-2的生長(zhǎng)情況較好，CMCase酶活力的測(cè)定ZC-1、NW-1和CJ-3的CMCase酶活力相對(duì)酶活較高，通過(guò)分析確定對(duì)CJ-3菌株進(jìn)行了初步的鑒定，根據(jù)菌落形態(tài)，菌株的顯微觀察和生理生化特征初步鑒定該菌株為單胞菌屬（Cellulomonas）。

本實(shí)驗(yàn)得到的部分菌株已經(jīng)進(jìn)行了保存，以便將來(lái)的繼續(xù)篩選，誘變作用，復(fù)合菌的聯(lián)合作用以及基因工程等進(jìn)一步研究。

［1］ 黃忠乾，龍章富，彭衛(wèi)紅，等.農(nóng)作物秸稈資源的綜合利用[J].資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng)，1999，15（1）：32-34.

［2］ 張木明，徐振林，張興秀，等.預(yù)處理對(duì)稻草秸稈纖維素酶解產(chǎn)糖及纖維素木質(zhì)素含量的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2006，58（3）：4-6.

［3］ 陳子愛(ài)，鄧小晨.微生物處理利用秸稈的研究進(jìn)展[J].中國(guó)沼氣，2006，24（3）：31-35.

［4］ 劉穎，林親錄.纖維素酶制取與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2006，4：33235.

［5］ 布坎南RE，吉本斯NE.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第八版，北京：科學(xué)出版社，1984.

book=2010,ebook=61

10.3969/j.issn.1008-1267.2010.01.013

Q93-331

A

1008－1267（2010）01-0034－02

2009-07-21

教育部春暉計(jì)劃（Z2007-1-01020）、內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJzy08233）、包頭市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2008y1002-2）

季祥（1978-），男，碩士，講師，從事生物質(zhì)能、生物制漿研究。蔡祿（1964-），男，博士，教授，從事生物質(zhì)能、生物信息、分子生物學(xué)研究。