趙永峰 蘇麗萍 鄭美婧 段靜靜

非霍奇金淋巴瘤治療的主要方法是化療。化療方法的選擇于淋巴瘤的組織病理學(xué)及與之相關(guān)聯(lián)的化療前預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。盡管近30年來(lái)，非霍奇金淋巴瘤患者的生存率提高了30%以上且大多數(shù)的患者都達(dá)到了原發(fā)緩解，但目前的治療方法仍無(wú)法讓人滿意。非霍奇金淋巴瘤治療失敗的原因是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。

MDR是指由一種藥物誘發(fā)，但同時(shí)又對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥［1］。乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是近年發(fā)現(xiàn)的一種耐藥相關(guān)蛋白，與P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)同屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，其過(guò)表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對(duì)蒽環(huán)類藥物、羥基喜樹堿等產(chǎn)生抵抗［2］。Patel等［3］的研究表明:COX-2 可以上調(diào) P 糖蛋白的表達(dá)。在對(duì)卵巢癌及乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)COX-2與P糖蛋白的表達(dá)明顯相關(guān)［4，5］。臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明COX-2抑制劑的使用有助于提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［6-9］。目前，在非霍奇金淋巴瘤關(guān)于COX-2和BCRP在多藥耐藥方面的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)61例非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白及、BCRP基因表達(dá)及治療反應(yīng)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集本院2008年9月至2009年7月收治的61例NHL患者，男35例，女26例，年齡18～81歲，中位年齡54歲。所有患者均經(jīng)過(guò)病理切片形態(tài)觀察、免疫組化確診，病理分型按2001年WHO腫瘤分類，其中含56例B細(xì)胞淋巴瘤，5例T細(xì)胞淋巴瘤。依據(jù)Ann Arbor系統(tǒng)對(duì)疾病的臨床進(jìn)展分類，I/II期36例，III/IV期25例。所有患者均接受6-8個(gè)療程的R-CHOP方案化療，其中31例化療敏感，30例化療耐受。在對(duì)數(shù)據(jù)分析時(shí)，依據(jù)IPI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為4組:低危組、中低危、中高危組以及高危組。10例反應(yīng)增生性淋巴結(jié)炎作為陰性對(duì)照組。

1.2 設(shè)備及儀器 主要檢測(cè)儀器:Perkin Elmer公司lamddaBio10型紫外分光光度計(jì)，PE2400型。PCR擴(kuò)增儀，Gene公司GDS-8000PCA凝膠成像分析系統(tǒng)。試劑:鼠抗人COX-2抗體及DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中山公司，SP免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。Trizol為Gibco產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司。BCRP上游引物:5’-AGATCAGCTACACCACCTCC-3’，下 游 引 物:5’-ACCCCGAACACCTTCTTA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度791bp;β-actin上游引物5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’: 下 游 引 物:5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度1359bp。

1.3 免疫組化 所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。SP法染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。已知COX-2陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定:COX-2主要于淋巴瘤瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，計(jì)數(shù)高倍視野下1000個(gè)以上腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占的百分比，以陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10%判定為COX-2表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 RT-PCR 手術(shù)獲得淋巴結(jié)標(biāo)本后立即放入液氮或-70℃低溫冰柜中保存。所有標(biāo)本均經(jīng)臨床病理證實(shí)TRIZOL提取法提取細(xì)胞總RNA紫外線分光光度計(jì)定量RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA。BCRP基因PCR條件:用β-actin作內(nèi)參照，按RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說(shuō)明書操作。反應(yīng)總體積為25μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min;94℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，共 35 個(gè)循環(huán);最后一循環(huán)于72℃5 min。取15μL產(chǎn)物用MCF一7/ADR做陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將結(jié)果掃描、照象。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組:乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中BCRPmRNA的表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá) COX-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為50.8%，BCRP基因在非霍奇金淋巴瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為45.8%，COX-2蛋白與BCRP基因在NHL的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異有顯著性，(P＜0.05)。

2.2 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中表達(dá)的相關(guān)性在31例COX-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的NHL患者中，BCRP mRNA陽(yáng)性表達(dá)20例，而30例在COX-2陰性表達(dá)的NHL患者中，BCRP mRNA陽(yáng)性表達(dá)僅8例。經(jīng)檢驗(yàn)COX-2蛋白和BCRP mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，χ2=8.795，r=0.355，P＜0.05。

2.3 COX-2蛋白和BCRP mRNA的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系COX-2和BCRP在NHL中的表達(dá)與臨床特征如年齡、性別、IPI、LDH、β2-微球蛋白等無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與Ann Arbor分期 III/IV明顯相關(guān)(P＜0.05)，見表1。

表1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

3 討論

我們研究了非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白和BCRP mRNA的表達(dá)，并對(duì)這些因子的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的潛在的相關(guān)性進(jìn)行了分析。在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中發(fā)現(xiàn)有COX-2的表達(dá);在45.8%的病例中發(fā)現(xiàn)有BCRP的表達(dá)。

環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成過(guò)程中一個(gè)重要的限速酶。人體環(huán)氧化酶主要有兩種異構(gòu)體:COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)型酶，在機(jī)體中穩(wěn)定表達(dá)，維持機(jī)體正常生理功能。COX-2是花生四烯酸代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在正常組織中表達(dá)陰性或弱陽(yáng)性，但在細(xì)胞受到各種致癌物刺激后表達(dá)上調(diào)。COX-2的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展(結(jié)腸癌，食道癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，皮膚癌，前列腺癌［10-17］，COX-2具有抗凋亡和促進(jìn)腫瘤血管生成的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)COX-2還可能具有調(diào)控腫瘤多藥耐藥的作用，是惡性腫瘤重要的預(yù)后不良因素之一。本實(shí)驗(yàn)中，在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中發(fā)現(xiàn)有COX-2的表達(dá)，提示其在非霍奇金淋巴瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，這與其他的一些惡性腫瘤相似。在這項(xiàng)研究中，腫瘤細(xì)胞COX-2的過(guò)度表達(dá)與非霍奇金淋巴瘤患者的臨床和/或病理學(xué)數(shù)據(jù)之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是與藥物泵出有關(guān)的ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中又一新的成員，首先由于Doyle等［18］1998年從有耐藥現(xiàn)象，但無(wú)P蛋白以及MRP1表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR發(fā)現(xiàn)的一種新的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白可將多種化合物從細(xì)胞內(nèi)排出。Yoh等［19］采用免疫組化方法檢測(cè)72例確診為ⅢB和Ⅳ期非小細(xì)胞性肺癌的老年人的腫瘤標(biāo)本中BCRP蛋白的表達(dá)，陽(yáng)性率為46%。與順鉑為主的聯(lián)合化療療效的相關(guān)性分析提示，BCRP陰性者與BCRP陽(yáng)性者有效率不同，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們的研究已經(jīng)證明了BCRP在非霍奇金淋巴瘤的表達(dá)與臨床效應(yīng)之間存在正相關(guān)。同時(shí)，我們觀察到BCRP與COX-2在非霍奇金淋巴瘤表達(dá)明顯相關(guān)，提示 COX-2在BCRP介導(dǎo)的非霍奇金淋巴瘤多藥耐藥中可能發(fā)揮重要作用。

總之，COX-2與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白BCRP之間的正相關(guān)，對(duì)于開展將COX-2抑制劑運(yùn)用于提高非霍奇金淋巴瘤的化療敏感性的遠(yuǎn)期臨床調(diào)查打下基礎(chǔ)。應(yīng)用相對(duì)價(jià)廉的COX-2抑制劑可能在很大程度上提高非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。既然BCRP的表達(dá)與臨床反應(yīng)相關(guān)，那么ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體似乎參與了非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的初始耐藥。BCRP作為非霍奇金淋巴瘤患者化療反應(yīng)和復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性的預(yù)測(cè)因子，在臨床上有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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