卓佳，陳柏坤，黃慧燕，徐瑜，張洪勤

(溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；2.附屬第二醫(yī)院)

白色念珠菌廣泛分布于自然界，也是人體的一種條件致病菌，正常人體的皮膚、口腔、腸道、肛門、陰道等處均可分離出該菌。近年來，隨著免疫抑制劑、介入性檢查治療手段的廣泛應(yīng)用，腫瘤化療、放療，器官移植，艾滋病和社會(huì)老齡化等因素引起的免疫功能低下人群比例增高，臨床真菌感染呈上升趨勢(shì)，尤其是近年來抗真菌感染的治療或者預(yù)防性治療，導(dǎo)致真菌感染菌株及耐藥趨勢(shì)發(fā)生變化[1]。本研究采用PCR分型方法，對(duì)臨床分離的121株白色念珠菌進(jìn)行基因分型，并對(duì)不同基因型白色念珠菌進(jìn)行藥物敏感性研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 2006年7月至2008年3月間溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨床分離的121株白色念珠菌。標(biāo)本來源于痰、咽拭子、生殖道分泌物、尿液、血液、糞便、腹水、傷口分泌物等。質(zhì)控菌株為白色念珠菌ATCC60193，購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器和試劑 法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基（CHRO Magar Candida）、API 20C AUX系統(tǒng)購自法國生物梅里埃公司；沙保弱瓊脂培養(yǎng)基、玉米-吐溫80培養(yǎng)基、含2%葡萄糖和0.5μg/mL美蘭的M-H瓊脂培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基(用于酵母原生質(zhì)體融合)：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH6.0（自制）；2%蝸牛酶；原生質(zhì)緩沖液：1 mol/L山梨醇，0.02 mol/L檸檬酸，0.02 mol/L磷酸氫二鈉，pH5.8；SE緩沖液：1 mol/L山梨醇，0.0625 mol/L EDTA，pH 8.0；丹麥ROSCO Neo-Sensitab抗真菌藥敏紙片：制霉菌素（NYS）50μg/片，氟康唑（FL）25μg/片、酮康唑（KET）15μg/片，咪康唑（MTC）10μg/片，兩性霉素B（AMB）10μg/片，伊曲康唑（IT）8μg/片，由杭州康裕貿(mào)易有限公司提供；PCR使用試劑，包括Taq聚合酶以及引物的合成，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；梯度PCR儀（Eppendorf公司）；Bio-RAD凝膠成像及分析系統(tǒng)（gel-Doc2000美國）。

1.3 菌株的分離鑒定 標(biāo)本按常規(guī)方法分離培養(yǎng)，對(duì)臨床懷疑真菌感染的標(biāo)本接種沙保弱培養(yǎng)基，將分離到的酵母樣真菌接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，37 ℃孵育48 h，根據(jù)生長(zhǎng)菌落的顏色作出鑒定，綠色菌落是白色念珠菌，紫色菌落是近平滑念珠菌，藍(lán)色菌落是熱帶念珠菌。

1.4 白色念珠菌DNA的提取 取沙保弱平板純培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種于YEPD培養(yǎng)基中，35 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。2000 r/min離心10 min，棄上清液。三蒸水洗2次。菌體加600μL 2%蝸牛酶溶于原生質(zhì)緩沖液，30 ℃水浴2 h。3000 r/min離心10 min，棄上清液。SE緩沖液 400μL懸浮細(xì)胞。3000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀加入450μL TE緩沖液，10% SDS 50μL，65 ℃水浴30 min。加200μL 5 mol/L乙酸鉀，冰浴1 h。12000 r/min離心5 min，取上清液，加等體積無水異丙醇，混勻，-20 ℃靜置20 min。12000 r/min離心20 min，棄上清液。加70%無水乙醇500μL，混勻，12000 r/min離心5 min，棄上清液，自然干燥，溶解于50μL TE緩沖液，-20 ℃保存。

1.5 白色念珠菌基因分型 采用特異引物擴(kuò)增白色念珠菌基因組DNA的25SrDNA基因的內(nèi)含子區(qū)，以內(nèi)含子大小及其中可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子片段的缺失或插入作為分型依據(jù)[2]。一對(duì)分型引物P1、P2分別位于可轉(zhuǎn)座內(nèi)含子的兩翼。

P1：5’-ATA AGG GAA GTC GGC AAA ATA GAT CCG TAA-3’（up），30 mer，

P2：5’-CCT TGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTA GAT-3’(down)，30 mer；

PCR反應(yīng)總體積30μL，含TaqDNA聚合酶0.2μL（1 U），dNTP1.5μL，引物P1、P2各1μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 藥敏試驗(yàn) 吸取一定量的0.5McFland菌懸液用生理鹽水1:1稀釋。以無菌棉拭子蘸取稀釋后的菌懸液從3個(gè)方向分別均勻接種于含2%葡萄糖和0.5μg/mL美蘭的M-H瓊脂培養(yǎng)基上，室溫靜置5～15 min，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于瓊脂表面。室溫置15 min后轉(zhuǎn)入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h（未見生長(zhǎng)者應(yīng)培養(yǎng)24～48 h），判定標(biāo)準(zhǔn)按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)2003年方案[3]，按要求測(cè)量抑菌環(huán)直徑，讀取藥敏結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 率的比較采用x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 以P1、P2為引物，以白色念珠菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物出現(xiàn)3種電泳圖譜，據(jù)此分為3型：A型為450 bp的單一條帶，B型為840 bp的單一條帶，C型出現(xiàn)450 bp和840 bp2條帶。質(zhì)控菌株白色念珠菌ATCC60193的電泳圖譜與A型相同。121株白色念珠菌的分型結(jié)果為：A型83株，B型27株，C型11株。見圖1。

2.2 不同基因型白色念珠菌的耐藥性分析 3種基因型白色念珠菌對(duì)伊曲康唑、氟康唑、咪康唑的耐藥率差異有顯著性（P＜0.05）。B型白色念珠菌對(duì)氟康唑、咪康唑的的耐藥率明顯高于A型菌株(分別為x2=4.682，P=0.030；x2=3.912，P=0.048)。C型伊曲康唑的耐藥率明顯高于A型菌株（x2=4.220，P=0.040）。具體見表1。

表1 A、B、C型白色念珠菌耐藥性分析

3 討論

隨著白色念珠菌臨床病例不斷增加，分子分型技術(shù)已成為研究念珠菌病流行病學(xué)及合理選擇藥物的基礎(chǔ)。rDNA廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在進(jìn)化過程中具有相同的起源和功能，可以反映物種間的進(jìn)化關(guān)系，已被廣泛應(yīng)用于多種生物的鑒定、分型及物種進(jìn)化分析。據(jù)證實(shí)[2，4]，白色念珠菌在25SrDNA編碼區(qū)內(nèi)存在一可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子，內(nèi)含子中至少存在三個(gè)插入片段：252、341、379 bp。形成可轉(zhuǎn)座I型內(nèi)含子的大小可有三種：379 bp（插入379 bp）、621 bp（插入379 bp和252 bp）、962 bp（插入379 bp、252 bp和341 bp）。5種型別中，A型（450 bp）無內(nèi)含子，B型（840 bp）為379 bp內(nèi)含子，D型（1080 bp）為621 bp內(nèi)含子，E型（1400 bp）為962 bp內(nèi)含子。379 bp內(nèi)含子對(duì)基因中核糖體串聯(lián)區(qū)的不對(duì)稱插入形成C型（450和840 bp），也有學(xué)者認(rèn)為C型可能是A型和B型通過有性繁殖方式產(chǎn)生的，或是兩組的過渡型，但是目前還沒有定論。

本實(shí)驗(yàn)中121株臨床分離的白色念珠菌經(jīng)PCR分為三型：A型67株，B型43株，C型11株。未發(fā)現(xiàn)D型（1080 bp）和E型（1400 bp）。A型為主要基因型，A型比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他兩型，與國內(nèi)亓慶國等[5]研究相一致；而Chen等[6]對(duì)臺(tái)灣分離的65株白色念珠菌分析表明A、B型比例相當(dāng)，表明不同地區(qū)或不同研究對(duì)象白色念珠菌基因型的分布是不同的。

121株白色念珠菌的基因分型和真菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)3種基因型白色念珠菌對(duì)伊曲康唑、氟康唑、咪康唑的耐藥率差異有顯著性（P＜0.05），對(duì)其他抗真菌藥物的耐藥率差異無顯著性。B型和C型白色念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥率明顯高于A型菌株。由此推論白色念珠菌特定基因型可能對(duì)某種抗真菌藥物易產(chǎn)生耐藥性，至于其耐藥機(jī)制是否與I型內(nèi)含子有關(guān)，目前還沒有相關(guān)報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。

臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極開展真菌耐藥性監(jiān)測(cè)，為臨床提供用藥依據(jù)，指導(dǎo)臨床合理使用抗真菌藥物，以達(dá)到有針對(duì)性的治療目標(biāo)，預(yù)防和控制耐藥菌株的產(chǎn)生和增加。恰當(dāng)?shù)幕蚍中涂蔀檠芯堪咨钪榫R床耐藥的分子機(jī)制及流行病學(xué)調(diào)查提供基礎(chǔ)，對(duì)控制真菌感染具有重大意義。

[1] Sandven P. Detection of fluconazole-resistant Candida strains by a disk diffusion screening test[J].J Clin Microbiol,1999,37(12):3856-3859.

[2] Mc Cullough M, Clemons KV, Stevens DA. Molecular and phenotypic charaacterization of genotypic Candida albicans subgroups and comparison with Candida dubliniensis and Candida stellatoidea[J]. J Clin Microbiol,1999,37:417-421.

[3] 徐應(yīng)春,王彭,謝秀麗,等. 美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)酵母菌紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)2003年版方案介紹[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2003,26(9):579-580.

[4] Tamura M, Watanabe K, Mikami Y, et al. Molecular characterization of new clinical isolates of Candida albicans and C.dubliniensis in Japan: analysis reveals a new genotype of C.albicans with group I intron [J]. J Clin M icrobiol, 2001,39(12):4309.

[5] 亓慶國,周學(xué)東,肖曉蓉,等. 正常兒童口腔中白色念珠菌的分布及基因分組[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003,23(9):674-677.

[6] Chen KW, Chen YC,LOHJ, et al. Multilocus sequence typing for analyses of clonality of Candida albicans strains in Taiwan [J]. J Clin Microbiol, 2006,44(6):2172-2178.