何淑敏 陳明

溫州大學(xué)體育學(xué)院（浙江溫州 325035）

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路［1-3］。破骨細(xì)胞分化因子RANKL（receptor activator of nuclear factor κB ligand）是由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的核因子－κB受體活化因子配體，它與破骨細(xì)胞的RANK（receptor activator of nuclear factorκB）結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟，提高其活性。RANKL的作用被認(rèn)為是拮抗骨細(xì)胞分泌的另一因子—護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的作用機(jī)制是：成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合后，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和激活。成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞則分泌OPG與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞活性。許多激素和因子通過(guò)影響OPG和RANKL的表達(dá)來(lái)影響骨代謝。在運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)可能在其中起到重要的作用。已有文獻(xiàn)［4］認(rèn)為適宜運(yùn)動(dòng)可以維持良好的鈣代謝平衡，提高鈣調(diào)節(jié)激素的分泌，促進(jìn)鈣的吸收和沉積，但目前尚無(wú)從OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)角度闡明運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨密度、骨量增長(zhǎng)機(jī)制的研究。本研究從OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)變化角度探討耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)期大鼠骨代謝、骨密度和骨量影響的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用20只3周健康雌性大鼠，由上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由飲食，室溫23±2℃，相對(duì)濕度55±5%，光照時(shí)間每天12小時(shí)，維持正常的24小時(shí)晝夜節(jié)律。經(jīng)過(guò)3周喂養(yǎng)和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，大鼠達(dá)到6周齡，然后隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

20只6周齡大鼠稱(chēng)重后隨機(jī)分成2組：對(duì)照組（Sed group）10只，不參加運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，正常飲食及生活；②12周訓(xùn)練組（Ex group）10只，進(jìn)行12周跑臺(tái)訓(xùn)練，每天1次，坡度為 0，第 1周 8m/min×10min，第 2周 15m/min×45min，第3周及以后25m/min×60min。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M田徑運(yùn)動(dòng)中的有氧耐力跑形式。采用段氏PT98型鼠類(lèi)跑臺(tái)進(jìn)行訓(xùn)練。

1.3 測(cè)試指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 血液標(biāo)本的制備和檢測(cè)

12周實(shí)驗(yàn)后，運(yùn)動(dòng)組停訓(xùn)24小時(shí)，所有大鼠于安靜狀態(tài)下稱(chēng)重后迅速斷頭取血，注入預(yù)冷的1%肝素塑料試管內(nèi)，混勻，低溫離心（3000r/min）10～15分鐘，取上清液置于－70°冰箱中待測(cè)血清維生素D3（VD3）、骨鈣素（OC）、骨堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）及 OPG和（可溶性）sRANKL。OPG和 sRANKL采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定（由上海西唐生物科技有限公司提供試劑盒），OPG組內(nèi)、組間差異分別是3～5%和6～9%，sRANKL組內(nèi)、組間差異分別是4～10%和7～8%。血清OC、ALP、TRAP采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定（試劑盒由上海滬尚生物科技有限公司提供），OC組內(nèi)、組間誤差分別是8%和5%；ALP組內(nèi)、組間誤差分別是5.2%和5.8%；TRAP組內(nèi)、組間誤差分別是5.7%和2.7%。維生素D由酶聯(lián)免疫法測(cè)定（英國(guó)IDS Ltd試劑盒），組內(nèi)、組間誤差分別是4.6%和5.3%。

1.3.2 骨骼標(biāo)本的制備和檢測(cè)

動(dòng)物斷頭后，取大鼠右側(cè)股骨、脛骨和第5腰椎，去除軟組織。測(cè)量3次股骨長(zhǎng)度，取平均值。采用雙能X線骨密度儀（DEXA）（Madison，W I，USA）測(cè)定脛骨和腰椎骨密度（BMD）和骨量（BMC）。脛骨測(cè)定骨密度（BMD）和骨量（BMC）位置為中間部位。DEXA測(cè)定有效范圍是：脛骨寬15毫米、長(zhǎng)50毫米；第5腰椎寬15毫米，長(zhǎng)20毫米。骨密度和骨量測(cè)量誤差小于2%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SAS 8.1（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照組相關(guān)指標(biāo)之間差異的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 體重、股骨長(zhǎng)度、脛骨和腰椎BMD、BMC

表1顯示，兩組大鼠實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)體重?zé)o顯著性差異。經(jīng)過(guò)12周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，兩組體重也無(wú)顯著差異。但運(yùn)動(dòng)組股骨顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P<0.05）。而運(yùn)動(dòng)組大鼠脛骨BMC明顯高于對(duì)照組（P<0.01），BMD兩組無(wú)顯著性差異；同樣，運(yùn)動(dòng)組大鼠腰椎BMC顯著高于對(duì)照組（P<0.05），BMD兩組無(wú)顯著性差異。

表1 兩組大鼠體重、脛骨和腰椎BMD、BMC比較

2.2 血清OPG/sRANKL、維生素D及骨代謝生化標(biāo)記物

表2顯示，運(yùn)動(dòng)組大鼠血清OPG水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05），而 sRANKL明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。運(yùn)動(dòng)組 OC（P<0.05）和 ALP（P<0.05）明顯高于對(duì)照組，而TRAP顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。運(yùn)動(dòng)組血清維生素D也顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

表2 兩組大鼠血清骨代謝生化標(biāo)記物、骨代謝調(diào)節(jié)因子比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12周實(shí)驗(yàn)后，與對(duì)照組比較，運(yùn)動(dòng)組大鼠血清OPG升高而sRANKL下降，反映合成代謝指標(biāo)OC、ALP升高而分解代謝指標(biāo)TRAP降低；與此相應(yīng)，運(yùn)動(dòng)組大鼠有更高的脛骨、腰椎骨量，提示OPG/RANKL系統(tǒng)的變化可能是運(yùn)動(dòng)促進(jìn)生長(zhǎng)期大鼠骨量增加的一個(gè)重要因素。有文獻(xiàn)報(bào)道OPG/RANKL系統(tǒng)是最重要的調(diào)節(jié)骨代謝的分子機(jī)制［1-3］。本研究結(jié)果表明：中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)使大鼠循環(huán)血OPG含量升高，sRANKL水平下降。這種變化可能是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)組大鼠骨量高于對(duì)照組的一個(gè)重要原因，其可能機(jī)制是：OPG升高和sRANKL下降都會(huì)導(dǎo)致sRANKL與破骨細(xì)胞膜上RANK受體結(jié)合的數(shù)量減少。由于RANKL-RANK配體受體結(jié)合是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟的重要機(jī)制［1-3］，因此它們結(jié)合減少會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化、成熟受到抑制，破骨細(xì)胞數(shù)量下降，這樣成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡向成骨方向傾斜，結(jié)果是骨形成大于骨吸收，骨量增加。這在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到證實(shí)：運(yùn)動(dòng)組大鼠腰椎、頸骨骨量更高，而且反映骨吸收的代謝因子TRAP也比對(duì)照組低，反映骨合成的代謝指標(biāo)OC和ALP卻高于對(duì)照組，這表明破骨細(xì)胞活性下降而成骨細(xì)胞活性增加，與OPG和sRANKL變化對(duì)骨組織的調(diào)節(jié)作用結(jié)果一致。Ziegler［5］報(bào)道耐力運(yùn)動(dòng)員循環(huán)血OPG水平升高，而sRANKL水平下降。這與本研究結(jié)果一致，但他們的實(shí)驗(yàn)僅單獨(dú)測(cè)定OPG和sRANKL變化，未測(cè)定骨量、骨密度和骨代謝因子。miyazaki等［6］報(bào)道卵巢切除大鼠RNAKL水平顯著增加，骨吸收過(guò)程非常活躍，指出RANKL是調(diào)節(jié)骨組織吸收過(guò)程的主要因素。因此，運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致OPG升高和sRANKL下降可能是耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)大鼠骨量增加的重要原因。

那么，運(yùn)動(dòng)如何改變OPG和RANKL分泌呢？機(jī)械力刺激是調(diào)節(jié)OPG、RANKL變化的一個(gè)重要因素。劉麗等［7］的研究表明，骨骼在機(jī)械力作用下，RANKL mRNA表達(dá)減少34.4%，而OPG mRNA表達(dá)增加73%，表明生理性應(yīng)力作用顯著影響大鼠骨細(xì)胞OPG和RANKL mRNA表達(dá)，提示對(duì)骨骼的機(jī)械力作用能減少骨組織吸收、促進(jìn)骨組織形成。其它文獻(xiàn)也證明OPG/RANKL比例增加主要是運(yùn)動(dòng)本身對(duì)骨組織機(jī)械力作用的結(jié)果，以及間接通過(guò)改變激素分泌而影響OPG/RANKL比例［8］。

破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生許多代謝因子，監(jiān)測(cè)其變化可以反映骨組織代謝平衡情況［9，10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)組血清OC、ALP升高，而TRAP下降。這說(shuō)明運(yùn)動(dòng)組大鼠成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)而破骨細(xì)胞活性減弱，成骨作用大于骨吸收作用，導(dǎo)致骨量增加。這在實(shí)驗(yàn)中也得到證明，運(yùn)動(dòng)組大鼠有更多的骨量。其它文獻(xiàn)也表明運(yùn)動(dòng)通過(guò)改變骨代謝過(guò)程而影響骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育［9，11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明耐力運(yùn)動(dòng)大鼠脛骨、腰椎骨量明顯比對(duì)照組增加，而B(niǎo)MD卻無(wú)顯著性差異。有文獻(xiàn)報(bào)道耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)骨密度和骨量產(chǎn)生重要影響［10］，而本研究只發(fā)現(xiàn)骨量增加。分析原因，我們的研究對(duì)象是生長(zhǎng)期大鼠，快速生長(zhǎng)期大鼠骨骼體積迅速增加，而礦物質(zhì)積累明顯滯后，因此這個(gè)時(shí)期骨密度增長(zhǎng)不明顯。而骨量由骨骼體積增長(zhǎng)和礦物質(zhì)增加兩方面決定，因此，即使礦物質(zhì)增加不明顯而骨骼體積增加也會(huì)導(dǎo)致骨量增長(zhǎng)，這也能從運(yùn)動(dòng)組股骨長(zhǎng)度比對(duì)照組更長(zhǎng)的結(jié)果得到證實(shí)。因此，耐力運(yùn)動(dòng)通過(guò)刺激骨骼體積增長(zhǎng)而促進(jìn)骨量增加。Iwamoto［4］也報(bào)道運(yùn)動(dòng)通過(guò)影響骨代謝變化而促進(jìn)骨量增長(zhǎng)，并認(rèn)為這種良性變化是鈣的良性平衡結(jié)果，與調(diào)節(jié)鈣代謝的激素相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，運(yùn)動(dòng)組血清維生素D明顯高于對(duì)照組，故運(yùn)動(dòng)也通過(guò)影響激素分泌促進(jìn)骨量增長(zhǎng)。因此，運(yùn)動(dòng)通過(guò)本身對(duì)骨組織的機(jī)械力作用和影響激素分泌而起到促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

4 總結(jié)

運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致OPG/sRANKL比例增加可能是耐力運(yùn)動(dòng)促進(jìn)生長(zhǎng)期大鼠骨量增加的重要因素，其可能機(jī)制是：運(yùn)動(dòng)對(duì)骨組織產(chǎn)生的機(jī)械力刺激導(dǎo)致OPG/sRANKL比率升高，而抑制破骨細(xì)胞活性，骨合成增加、吸收減少，腰椎、股骨骨量增加。

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