王 艷 （山東省棗莊市畜牧獸醫(yī)局 277800）

對于一個有商業(yè)潛質(zhì)和廣闊市場前景的獸用蛋白質(zhì)類藥物的研究，主要是要尋找一條穩(wěn)定的工藝條件和獲得較高的工作效率，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)就具有這方面的優(yōu)點，其優(yōu)越性表現(xiàn)在：分泌性表達，不需要復(fù)性，有效率為100%，純化程序簡單，大大降低了生產(chǎn)成本，尤其適用于動物干擾素的表達。

1 巴斯德畢赤酵母(Pichia Pastoris)表達系統(tǒng)的特點

巴斯德畢赤酵母是近年來興起的一個真核高效表達系統(tǒng)，具有許多獨特的優(yōu)點，已迅速發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域中被廣泛用于重組蛋白生產(chǎn)的主要表達系統(tǒng)之一[1]。Pichia Pastoris是一種噬甲基酵母，可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長。它含有兩個基因編碼醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)—AOX1和AOX2，兩者序列相似，有92%的同源性，其編碼蛋白有97%的同源性和幾乎相同的特異催化活性。但在細胞中乙醇氧化酶的主要活力由AOX1提供，AOX2提供乙醇氧化酶的活力很低。在以甲醇作唯一碳源的培養(yǎng)基上，含有AOX1的酵母菌株生長表現(xiàn)為正常野生型Mut+，如果AOX1基因遭到破壞或被替換，只有AOX2的酵母菌株利用甲醇的能力減弱，則表現(xiàn)為生長緩慢性MutS。

根據(jù)其生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特征，P.pastoris作為外源蛋白表達系統(tǒng)非常成功，總結(jié)如下[2]：（1）酵母屬于單細胞微生物；保留了細菌的特點，其營養(yǎng)要求簡單，生長快；操作方便易于培養(yǎng)，低成本，高密度，發(fā)酵技術(shù)也已非常成熟。（2）酵母是低等真核生物，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)，毒性比細菌小。（3）酵母具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu)，可進行很多典型的高等真核生物的蛋白翻譯后加工修飾；如糖基化、脂酸化、磷酸化以及蛋白裂解、折疊、二硫鍵的形成等。（4）Pichia Pastoris的分子生物學(xué)操作技術(shù)與釀酒酵母(S.cerevisiae )非常相似，而后者的遺傳背景和生理特性研究得比較透徹，是應(yīng)用很廣泛的表達系統(tǒng)之一。（5）在醇氧化酶1(AOX1)基因來源的強啟動子的嚴格調(diào)控誘導(dǎo)下，無論胞內(nèi)還是分泌，均可實現(xiàn)外源基因的高表達，而且產(chǎn)物易于純化，特別是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分離，適于商業(yè)生產(chǎn)[3]。

2 巴斯德畢赤酵母的表達載體

由于巴斯德畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加載體(stable episomal vecters)，所以一般用整合型載體也稱穿梭載體作為外源基因的表達載體。即幾乎所有的畢赤酵母表達載體都設(shè)計為穿梭載體，即在酵母和大腸桿菌中都能復(fù)制的載體，包含大腸桿菌的質(zhì)粒復(fù)制源和氨芐青霉素抗性基因。它可以在大腸桿菌中保存、擴增、和構(gòu)建，線性化后轉(zhuǎn)入酵母細胞，使用方便。它有胞內(nèi)表達載體如pPIC3、pPSC3k等和分泌性表達載體如pPIC9、pPIC9K等兩種類型，都有一些共同的結(jié)構(gòu)，例如：AOX1基因的5′AOX1啟動子，編碼N端分泌信號(SIG)，多克隆位點(MCS)，轉(zhuǎn)錄終止和PolyA形成基因(TT)，3′AOX1序列，3′AOX1終止序列，篩選標記等等[4-6]。

3 巴斯德畢赤酵母的表達蛋白質(zhì)的糖基化

該表達系統(tǒng)不存在原核表達系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以去除的問題，也不存在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的病毒和支原體的污染等問題，畢赤酵母能對表達的蛋白質(zhì)進行N-和O-糖基化[7]，其中N-糖基化對于許多蛋白質(zhì)的正確折疊、藥物動力學(xué)穩(wěn)定性和功能是必需的，人們對其研究也相對深入。但是并不是說所有的潛在的糖基化位點均會發(fā)生糖基化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含有一致性序列Asn-Xaa-Thr/Ser(Xaa代表任何氨基酸)時，畢赤酵母能對其中的天冬氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，產(chǎn)生N-糖基化。畢赤酵母能對蛋白質(zhì)中蘇氨酸和/或絲氨酸上的羥基進行糖基化，產(chǎn)生O-糖基化。糖基化對重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和功能的影響因蛋白質(zhì)而異，原因尚不明確。

4 提高外源蛋白在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達量的策略

要想實現(xiàn)外源蛋白在該系統(tǒng)的高效生產(chǎn)，就必須在實驗設(shè)計和具體操作中從下列環(huán)節(jié)予以重視，盡可能達到最優(yōu)化。（l）應(yīng)對所要表達的外源蛋白及其基因的結(jié)構(gòu)、功能和特性有較全面、細致的了解；（2）注意信號肽的選擇，可以采用目的基因的信號肽，也可選擇載體自身的信號肽，但二者對蛋白的分泌效果不盡相同；（3）選擇合適的載體及合理的載體構(gòu)成方式；（4）選擇恰當(dāng)?shù)氖荏w菌，如帶有抗性標記、多拷貝篩選標記、蛋白水解酶缺失株等，既利于操作，有利于高效生產(chǎn)；（5）改進轉(zhuǎn)化方法與篩選鑒定方法，由于表達單位的不同整合方式、拷貝數(shù)、陽性轉(zhuǎn)化子，表達量的特異、快捷鑒定方法對獲得高表達株有重要意義[8]，因此應(yīng)采用即操作簡便又可提高轉(zhuǎn)化率和表達單位拷貝數(shù)的方法，通常利用原生質(zhì)法、電轉(zhuǎn)化法等，可根據(jù)實驗條件具體選擇；（6）采用較好的培養(yǎng)基和適宜的生長條件；（7）注意摸索誘導(dǎo)發(fā)酵參數(shù)，采用現(xiàn)代的發(fā)酵工藝，如目前的批量表達與連續(xù)灌注發(fā)酵罐。總之，雖然 P.pastoris表達系統(tǒng)是一個較好的被廣泛應(yīng)用的真核表達系統(tǒng)，但是由于天然蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和多樣性，以及外源基因與酵母基因組重組情況的某些不可預(yù)知性，使得特定的外源基因的高效分泌表達并不可能一蹴而就，尚有許多的條件需要具體的摸索、嘗試和優(yōu)化。

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