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高效液相色譜-熒光法檢測(cè)禽肉中七種氟喹諾酮類藥物殘留的研究

2010-08-16 05:59:50王維霞許永國(guó)王秀穎周大慶山東省諸城綠安檢測(cè)有限公司262200
山東畜牧獸醫(yī) 2010年10期
關(guān)鍵詞:雙氟諾氟沙星環(huán)丙沙星

王維霞 許永國(guó) 王秀穎 周大慶 (山東省諸城綠安檢測(cè)有限公司 262200)

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinnolones,F(xiàn)Qs)是近年來(lái)發(fā)展迅速并被廣泛應(yīng)用的新一代全合成抗生素。它抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強(qiáng),抗菌作用是磺胺類藥的近千倍,與第3代頭孢類抗生素相媲美。由于FQs是化學(xué)合成藥物,價(jià)格低廉,故在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛。在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中,F(xiàn)Qs主要用于治療、預(yù)防和促生長(zhǎng)。因其在體內(nèi)代謝緩慢易殘留,且致病菌產(chǎn)生耐藥性和某些FQs的潛在致癌問(wèn)題,其殘留問(wèn)題越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注。2006年日本肯定列表中嚴(yán)格規(guī)定了氟喹諾酮類藥物檢出限量,其中對(duì)沙拉沙星限量要求最高達(dá)0.01ug/kg,其次諾氟沙星也高達(dá)0.02μg/kg 。

目前,用于FQs殘留檢測(cè)的方法有微生物法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、免疫分析法等。但在現(xiàn)行國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)和報(bào)道文獻(xiàn)中常用的高效液相色譜法只能檢測(cè)2、3種藥物殘留,本研究采用液液萃取進(jìn)行樣品前處理,用帶熒光檢測(cè)器的液相色譜儀梯度洗脫檢測(cè),可同時(shí)測(cè)定氧氟沙星(OFLX)、諾氟沙星(NOR)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIF)、達(dá)氟沙星(DAN)、雙氟沙星(DIF)、沙拉沙星(SRA)。本方法靈敏度高、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速,還有重現(xiàn)性好、檢測(cè)成本低的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國(guó)WATERS公司高效液相色譜儀,配有2475熒光檢測(cè)器,1525二元泵,WATERS SymmetryShieldTMRP18色譜柱;美國(guó)Milli-Q純水儀;日本柴田 HW2B-20/20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;上海安亭離心機(jī)LD5-2A;北京醫(yī)用高速離心機(jī)LG16-W。

1.2 試劑和材料

乙腈、甲醇、正已烷均為色譜純;氫氧化鈉、磷酸、三乙胺、正丙醇為分析純;純水。氟喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星、沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥98%,日本關(guān)東株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.3 色譜條件

色譜柱:WATERS SymmetryShieldTMRP18 4.6mm×250mm,5um;保護(hù)柱:柱溫:38℃;流動(dòng)相A:0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-乙腈(88+12)B:0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-甲醇(70+30);波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)280nm,發(fā)射波長(zhǎng)450nm;進(jìn)樣量:20μl;流速0.8ml/min梯度表為:

時(shí)間(min) 0 3 9 17 19 24流動(dòng)相A(%) 100 100 0 0 100 100流動(dòng)相B(%) 0 0 100 100 0 0

1.4 樣品的制備

稱取3.0g絞碎的樣品于100ml離心管中,加入20ml氫氧化鈉溶液(pH=12)-乙腈(1+19)提取液,15000r/min均質(zhì)1min,3000r/min離心5min,將上清液倒入已加入25ml乙腈飽和正己烷溶液的100ml分液漏斗中,振搖5min,靜置分層;收集下層于100ml雞心瓶中,用20ml提取液洗刀頭,把洗刀頭液加入殘?jiān)?,渦旋混勻1min,超聲5min,3000r/min離心5min,將上清液合并于分液漏斗中,振搖5min,靜置分層;收集下層合并于雞心瓶中,加10ml正丙醇,40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干;加入1.0ml流動(dòng)相A溶解殘?jiān)?,超?min;移入1.5ml離心管中;加入0.5ml乙腈飽和正己烷溶液,12000r/min離心5min,若下層混濁除去正己烷層后重復(fù)加入乙腈飽和正己烷離心,直至變清為止,用2ml 1次性注射器吸取下層溶液,用0.45μm濾膜過(guò)濾,供HPLC分析。

1.5 測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 準(zhǔn)確稱取7種標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg,分別加于7只100ml棕色容量瓶,用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度,即成100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于2~8℃中保存3個(gè)月。吸取達(dá)氟沙星0.2ml外其余標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0ml于100ml的棕色容量瓶中,用流動(dòng)相A定容至刻度,即成1.0(dan0.2)μg/ml標(biāo)準(zhǔn)混合中間工作液. 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合中間工作液2、5、10、50、100、200μl,用流動(dòng)相A定容至刻度,稀釋成濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2μg/ml,達(dá)氟沙星濃度為0.0004、0.001、0.002、0.01、0.02、0.04μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5.2 樣品空白和空白添加回收試驗(yàn) 每個(gè)批次試驗(yàn)中,均做1個(gè)空白樣品和1個(gè)空白樣品添加回收??瞻讟悠诽砑恿繎?yīng)等于最大殘留限量,或方法定量限遠(yuǎn)優(yōu)于最大殘留限量時(shí),應(yīng)選在等于方法定量限上。本方法添加回收選在要求最嚴(yán)的最大殘留限量0.01μg/g試驗(yàn)回收不僅用于對(duì)陽(yáng)性殘留結(jié)果的校正還可考量每批次檢測(cè)的可靠性。

1.5.3 結(jié)果計(jì)算 陽(yáng)性樣品結(jié)果計(jì)算根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖比較,選用峰響標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度單點(diǎn)校正,按:C=計(jì)算。C-樣品中對(duì)應(yīng)的每一種沙星的殘留量(μg/g);V-最終定量體積數(shù)(ml);A-樣品溶液中對(duì)應(yīng)的每一種沙星色譜峰面積;A0-空白樣品溶液中對(duì)應(yīng)的每一種沙星色譜峰面積;AS-標(biāo)準(zhǔn)工作液中對(duì)應(yīng)的每一種沙星的峰面積;CS-標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的每一種沙星的濃度(μg/ml);m-樣品重量(g);R—樣品回收率。

1.5.4 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 靈敏度:本方法的禽肉組織中達(dá)氟沙星的定量檢出限為0.001μg/g,氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星定量檢出限均為0.005μg/g。準(zhǔn)確度和精密度:本方法在0.01μg/g添加水平下樣品的回收率范圍82%~94%,RSD<10%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

在FQs的HPLC分析中標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中大多采用反相色譜柱,如C18、C8等,因此選用相對(duì)成熟的C18柱,WATERS SymmetryShieldTMRP18色譜柱硅膠表面具有良好的低活性,分離度好,峰型尖銳。

2.2 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道比較,采用磷酸緩沖溶液作流動(dòng)相可以得到良好的峰型,經(jīng)使用農(nóng)業(yè)部236號(hào)公告的磷酸緩沖溶液分析效果較好,但保護(hù)柱和色譜柱的使用壽命較短,參考色譜耐酸堿度和文獻(xiàn)報(bào)道,把pH2.4調(diào)為pH3.0,經(jīng)長(zhǎng)期驗(yàn)證,分析效果基本相同,保護(hù)柱和色譜柱使用壽命延長(zhǎng)1倍多。由于雙氟沙星和沙拉沙星主要基團(tuán)相似而分離不開(kāi),出峰時(shí)間在30min,分析時(shí)間長(zhǎng),故加入只對(duì)雙氟沙星和沙拉沙星溶解度差別大的甲醇來(lái)調(diào)節(jié)。經(jīng)試驗(yàn)用0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-乙腈-甲醇(83+10+7)完全分離最好,出峰時(shí)間在28min,分析時(shí)間長(zhǎng),不理想。為減少分析時(shí)間,采用梯度洗脫,經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證選用0.05mol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH3.0)-甲醇(70+30)梯度洗脫在20min內(nèi)可完全分離,全部運(yùn)行時(shí)間為24min。見(jiàn)圖1。

圖1 7種氟喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

FQs的前處理方法國(guó)內(nèi)外報(bào)道很多.采用酸性或堿性有機(jī)相提取都有較好的回收率,但采用液液萃取蒸發(fā)濃縮,時(shí)間較長(zhǎng)又不易蒸發(fā)至干。參考NY/TDJ320-2001檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程和《獸藥殘留分析》,對(duì)較難蒸發(fā)的磷酸鹽堿性乙腈提取液調(diào)為氫氧化鈉溶液堿性乙腈,為保證堿度和禽肉組織足夠用量,經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,氫氧化鈉溶液(pH=12)-乙腈(1+19)提取液滿足要求。7種氟喹諾酮的回收率均在70%以上,提取效果好。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

用1.0(dan0.2)μg/ml標(biāo)準(zhǔn)混合中間工作液,稀釋成濃度分別為0.001、0.002、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2μg/ml,達(dá)氟沙星濃度為0.0002、0.0004、0.001、0.002、0.01、0.02、0.04μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。線性關(guān)系見(jiàn)表1。

當(dāng)添加7種氟喹諾酮,達(dá)氟沙星0.0004μg/g,氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.002μg/g時(shí),色譜圖信噪比大于3,故以此作為方法的檢出限。見(jiàn)圖2~3。

圖2 空白樣品的色譜圖

圖3 樣品添加達(dá)氟沙星0.0004μg/g,氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.002μg/g時(shí)的色譜圖

當(dāng)添加7種氟喹諾酮,達(dá)氟沙星0.001μg/g,氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.005μg/g時(shí),色譜圖信噪比大于10,故以此作為方法的定量限。見(jiàn)圖4。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

圖4 樣品添加達(dá)達(dá)氟沙星0.001μg/g,氧氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、雙氟沙星均為0.005μg/g時(shí)色譜圖

分別以雞肉和鴨肉做添加回收實(shí)驗(yàn),分別添加0.002、0.01、0.2μg/g,(DAN0.0004、0.002、0.04)3個(gè)濃度水平七種氟喹諾酮的混合標(biāo)樣,每個(gè)濃度雞肉和鴨肉各做3個(gè)平行試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2~4。

表2 樣品添加0.002(0.0004)μg/g的7種氟喹諾酮的試驗(yàn)結(jié)果 (%)

表3 樣品添加0.01(0.002)μg/g的7種氟喹諾酮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (%)

表4 樣品添加0.2(0.04)μg/g的7種氟喹諾酮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (%)

3 結(jié)論

本研究建立了可同時(shí)檢測(cè)禽肉中7種氟喹諾酮類藥物的方法。它靈敏度高、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速,還有重現(xiàn)性好、檢測(cè)成本低,可幫助出口日本歐盟企業(yè)用于禽肉中的氟喹諾酮類藥物檢測(cè)。

[1]肉及肉制品中恩諾沙星殘留檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/TDJ320-2001.

[2]農(nóng)業(yè)部第236號(hào)公告. 動(dòng)物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測(cè)方法-高效液相色譜法[S]. 2003.

[3]農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告. 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜法[S]. 2006.

[4]李俊索, 邱月明, 王超等. 獸藥殘留分析[M]. 上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2002: 228-264.

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