楊海玲 ，曾勇慶，王 慧*

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；2. 青島市畜牧獸醫(yī)工作站，青島 266001）

目前，影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的瓶頸除飼料和市場(chǎng)問題，還有各種疫病所帶來的威脅。免疫接種、藥物防治、衛(wèi)生隔離和改善環(huán)境等措施，雖取得一定的效果，但仍不能完全控制或消滅疫病的蔓延。藥物和疫苗的大量使用使得病原微生物變異加快，疫病控制更加困難。在這種背景下，借助于現(xiàn)代分子遺傳育種的理論和手段，通過生物技術(shù)等綜合育種措施，培育抗病力強(qiáng)的新品種，成為控制病害的最有效途徑和最終目標(biāo)。

1 抗病育種的遺傳基礎(chǔ)

豬的抗病力可分為一般抗病力和特殊抗病力，其遺傳基礎(chǔ)不同。一般抗病力不限于抗一種病原體，它受多基因及環(huán)境的綜合影響，具體體現(xiàn)在機(jī)體對(duì)疾病的防御機(jī)能和對(duì)抗原的免疫應(yīng)答能力的不同，較少受病原體來源、類型和入侵方式的影響。研究表明，當(dāng)一般疾病的抗性轉(zhuǎn)為特殊免疫反應(yīng)時(shí)，由于抗體反應(yīng)一般有較高的可遺傳性，其遺傳力會(huì)增加。Morris等研究認(rèn)為，對(duì)特殊疾病抗病性狀的選擇類似于對(duì)生產(chǎn)性狀的選擇。所以，在豬的抗病育種中，既要針對(duì)特殊抗病力進(jìn)行選擇；又要針對(duì)一般抗病力進(jìn)行選擇，二者同等重要。特殊抗病力可通過特殊病原體直接攻毒試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定；一般抗病力則比較復(fù)雜，如何衡量目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。由于一般抗病力體現(xiàn)了機(jī)體對(duì)疾病的整體防御功能，因此，提高機(jī)體的一般抗病力也就是提高機(jī)體的整體免疫機(jī)能。

2 抗病育種的技術(shù)方案和選擇方法

抗病育種是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，必須從篩選抗病突變基因或基因型、提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力、提高總體抗病力等方面著手?？共∮N的技術(shù)方案包括直接選擇法和間接選擇法。

直接選擇法是通過篩選抗病個(gè)體、同胞和后裔，或通過克隆等方法進(jìn)行。直接選擇具有直觀和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但由于疾病性狀的遺傳力較低、世代間隔長(zhǎng)，尤其是有些抗病性狀和生產(chǎn)性狀往往存在負(fù)的遺傳相關(guān)等，使得直接進(jìn)行抗病選育十分困難。

間接選擇法是通過疫苗攻擊、體外實(shí)驗(yàn)、基因組掃描、篩選遺傳標(biāo)記和QTL定位等方法進(jìn)行的。近年來，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)發(fā)表了許多有關(guān)資源家系中與抗病力或免疫相關(guān)的QTL定位的研究成果。Anderson等1998年完成了對(duì)免疫反應(yīng)的若干參數(shù)的研究，并查明了一些免疫力QTL。Edfors-Lilja等1998年定位了影響豬免疫性狀的QTL，其中4個(gè)達(dá)到染色體水平的顯著效應(yīng)。Edfors-Lilja等（2000）在野豬與約克夏豬的雜交F2代群體中定位了豬應(yīng)激狀態(tài)下白細(xì)胞計(jì)數(shù)的QTL，同時(shí)也定位了4個(gè)在染色體水平呈顯著效應(yīng)的QTL。2005年Wattrang等進(jìn)一步確認(rèn)影響豬白細(xì)胞數(shù)、血液參數(shù)和白細(xì)胞功能的QTL在1號(hào)和8號(hào)染色體上。這些抗病基因或QTL的發(fā)現(xiàn)和定位，為開展動(dòng)物抗病育種研究奠定了重要基礎(chǔ)。

3 豬免疫或抗病相關(guān)的候選基因

豬抗病育種的最終目標(biāo)是培育出整體免疫力高的品種或品系。要借助于標(biāo)記輔助選擇培育和提高豬的抗病力，需要首先找到與抗病性或免疫相關(guān)的候選基因。

3.1 MHC超基因族

主組織相容性復(fù)合體（MHC）是由緊密連鎖的高度多態(tài)性的基因位點(diǎn)所組成的染色體上的一個(gè)遺傳區(qū)域，廣泛存在于脊椎動(dòng)物，在豬中又稱為SLA。SLA復(fù)合體基因由Vaimin等首次發(fā)現(xiàn)，隨后Rabin等將其定位于豬7號(hào)染色體。Smith等進(jìn)一步將其定位于豬7號(hào)染色體著絲粒兩邊，由3個(gè)基因簇或區(qū)域組成。SLA一般分為3大類，即I類基因、II類基因和III類基因，其中I類基因具有高度多態(tài)性。大量研究表明，SLA與抗病力和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。Tissot等發(fā)現(xiàn)遺傳性皮膚惡性黑瘤與SLA復(fù)合體有關(guān)。Renard等發(fā)現(xiàn)腹瀉造成的斷奶前死亡率與SLA的單倍型類型有關(guān)，Lunney等發(fā)現(xiàn)SLA的不同單倍型對(duì)寄生蟲的抗性存在類型的差異。姜范波等發(fā)現(xiàn)，SLA基因在二花臉豬免疫系統(tǒng)的高表達(dá)可能是該豬種高抗逆性的基礎(chǔ)之一。預(yù)計(jì)在不遠(yuǎn)的將來，育種工作者可以利用SLA作為一種遺傳標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，以培育出一般抗病力強(qiáng)且高產(chǎn)的豬品種。

3.2 天然抗性相關(guān)巨嗜蛋白（NRAMP1）基因

NRAMP1定位于豬的第15號(hào)染色體（15q23-26）。吳宏梅研究了豬NRAMP基因PCR-RFLP多態(tài)性與免疫指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在第6內(nèi)含子區(qū)遺傳變異對(duì)免疫功能有一定的影響，可作為一個(gè)很有價(jià)值的一般抗病力的候選基因。

3.3 K88受體和F18受體基因

腸毒素型大腸桿菌（ETEC）是引起仔豬腹瀉的主要病原菌，可引發(fā)仔豬黃痢、白痢、水腫病等多種大腸桿菌病。ETEC的致病能力決定于它們?cè)谒拗餍∧c上皮細(xì)胞的定居能力和產(chǎn)生腸毒素能力；而定居能力則由菌體表面的特異菌毛（稱為黏附素）介導(dǎo)。按黏附素的性質(zhì)（抗原性）可將E.coli分為K88（F4）、K99（F5）、F41（F6）、F17和F18等（房海，1997）。Sellwood等首次發(fā)現(xiàn)對(duì)E.coliK88ac粘附素引起的腹瀉具有抗性的豬是由于小腸粘膜缺乏相應(yīng)的受體。ETECK88ac粘附素受體按孟德爾兩等位基因方式遺傳，顯性表現(xiàn)粘附性，隱性表現(xiàn)為抗性。研究表明仔豬體內(nèi)如果缺乏E.coliK88受體或F18受體，就會(huì)對(duì)相應(yīng)的血清型大腸桿菌引起的腹瀉產(chǎn)生抗性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在豬小腸上皮細(xì)胞分離到的兩種粘液型唾液糖蛋白，分子量分別為210KDa（IMTGP-1）和240KDa（IMTGP-2），被認(rèn)為是豬對(duì)K88ab和K88ac易感性和抗性重要的決定因子。用外切糖苷酶消化IMTGP-1和IMTGP-2試驗(yàn)表明，β-半乳糖是K88ac識(shí)別IMTGP-1和IMTGP-2的重要成分，而K88ad受體是一種中性糖鞘脂，命名為IGLad，K88粘附素識(shí)別受體的最少氨基酸序列可能是β-N-乙酰己糖胺（β-HexNAC），而HexNAC末端β-半乳糖的存在會(huì)增強(qiáng)K88粘附素的結(jié)合。EcoliF18是引起斷奶仔豬腹瀉及水腫病的主要病原菌,Bertschinser發(fā)現(xiàn)，斷奶前后仔豬水腫病是F18菌株與細(xì)胞表面受體結(jié)合釋放腸毒素而引起的，缺乏受體能抗腹瀉和水腫病。F18受體基因定位于豬的6號(hào)染色體，并與血型抑制因子S、紅細(xì)胞酶系統(tǒng)及氟烷基因緊密連鎖。Meijerink等發(fā)現(xiàn)，巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1（FUT1）可作為EcoliF18R的候選基因，AA型為抗性基因型，據(jù)此進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇和標(biāo)記輔助交配，有可能提高群體中A基因頻率，培育抗病品系，實(shí)現(xiàn)抗病育種。

3.4 氟烷（RYR1）基因

氟烷基因是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合征（PSS）的遺傳基礎(chǔ)，應(yīng)激敏感豬在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生PSE等劣質(zhì)豬肉。同時(shí)C1843-T1843突變改變了HhaI酶切位點(diǎn)，因而可通過此突變位點(diǎn)判斷豬對(duì)應(yīng)激的敏感性。據(jù)報(bào)道，Haln基因型頻率隨豬胴體瘦肉率的提高在群體中呈上升趨勢(shì)。在我國(guó)地方品種中，Haln基因頻率很低或不存在Haln基因，但部分品種中也有Haln基因存在。在育種過程中，可通過基因檢測(cè)技術(shù)將氟烷敏感基因從群體中剔除。比利時(shí)Hanset已成功地利用分子標(biāo)記輔助導(dǎo)入將抗應(yīng)激的氟烷陰性基因?qū)肫ぬ靥m豬中。

3.5 MX1蛋白

MX1蛋白是一種GTPase結(jié)合蛋白，具有抗病毒作用。Muller等從豬的細(xì)胞中分離克隆了全長(zhǎng)MX1cDNA序列，包括一個(gè)663個(gè)氨基酸開放閱讀框，預(yù)測(cè)分子量75.6kDa。Morozumi等報(bào)道了在豬MX1基因第14外顯子發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的多態(tài)性位點(diǎn)，在不同品種中等位基因頻率呈現(xiàn)很大差別。

3.6 干擾素（IFN）基因

干擾素是1957年Isaacs和Lindenmann從病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)中分離到的一種生物活性物質(zhì)，因這種因子可干擾其他病毒的復(fù)制，故命名為干擾素。目前所發(fā)現(xiàn)的豬干擾素包括INF-α、β、ω、δ和INF-γ，并且IFN-δ未在其它物種中發(fā)現(xiàn)（Domeika,2003）。由于INF-γ不但具有抗病毒作用，而且具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，因此可作為疾病抗性的良好候選基因。INF-γ作為抗病性候選基因研究正在廣泛展開。

3.7 其他候選基因

免疫球蛋白及其受體基因、C5基因、白細(xì)胞介素基因、Toll樣受體基因等作為抗病候選基因正在進(jìn)行廣泛的研究。

補(bǔ)體蛋白C3（Complement3,C3）是補(bǔ)體的一個(gè)重要成分，參與豬的免疫調(diào)節(jié)。C3基因的多態(tài)性與補(bǔ)體有顯著關(guān)系，所以C3基因是抗病原微生物的重要候選基因（Wimmers等,2003；Mekchay等,2003）。補(bǔ)體蛋白C5（Complement5,C5）也是補(bǔ)體的一個(gè)組成成分，該基因在細(xì)胞免疫和體液免疫以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。C5蛋白基因的SNP與免疫學(xué)參數(shù)之間有顯著的關(guān)聯(lián)，所以Kumar等（2004）認(rèn)為C5蛋白基因是一個(gè)重要的抗病候選基因。

此外，范志勇等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、谷氨酸胺(Gln)和pGRF基因質(zhì)粒的不同組合形式在增強(qiáng)仔豬兔疫功能方面表現(xiàn)出良好效果。

4 結(jié)語

盡管與抗病、免疫能力有關(guān)的QTL和候選基因研究在豬上已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但是，抗病育種還面臨諸多困難。首先，多數(shù)情況下，疾病感染是數(shù)量性狀，是由多個(gè)微效基因控制的；且這種數(shù)量性狀的遺傳力很低，通過常規(guī)育種選擇，進(jìn)展緩慢。第二，基因的表達(dá)調(diào)控一般受控于一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，通常不會(huì)單獨(dú)起作用，這給分子標(biāo)記輔助選擇帶來了極大的干擾和難度。第三，抗病性或易感性指標(biāo)難以測(cè)定，且在獸醫(yī)臨床上對(duì)某些疾病的準(zhǔn)確診斷通常非常困難，如仔豬腹瀉可以由不同類型的大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原微生物引發(fā)。第四，抗病性的遺傳機(jī)制非常復(fù)雜且受環(huán)境因素的影響較大，這給研究帶來極大的不便。第五，培育抗病性和易感性極端差異的動(dòng)物品系很困難。盡管如此，利用動(dòng)物的遺傳特性來培育抗病品種仍具有很大的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)動(dòng)物抗病性的研究也會(huì)受到遺傳育種學(xué)家們的高度關(guān)注。致謝：本文受國(guó)家發(fā)改委生物育種高技術(shù)專項(xiàng)（2007249051），山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題（2007LZ013），山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2008D32）和山東省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（J07WF08）資助。