葉俊華

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在犬繁育中的應(yīng)用

葉俊華

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是生命科學前沿技術(shù)之一。它是指將人工分離和修飾過的外源基因?qū)氲缴矬w的基因組中，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生改變的技術(shù)，可分為轉(zhuǎn)基因動物與轉(zhuǎn)基因植物兩大分支?？茖W家的初衷是想利用該技術(shù)造福人類，使之既可加快農(nóng)作物和家畜品種的改良速度，提高人類食物的品質(zhì)；又可以生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白，為患者帶來福音。近年來，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展十分迅猛，除有轉(zhuǎn)基因豬、鼠、魚、兔、牛、羊的成功報導外，2009年，已有轉(zhuǎn)基因犬的成功問世。本文就轉(zhuǎn)基因技術(shù)及轉(zhuǎn)基因犬研究現(xiàn)狀與前景作一簡要介紹。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)概念

基因（gene）：人們常說的基因，也稱為遺傳因子，是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA（脫氧核糖核酸）分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段?；蛲ㄟ^復制把遺傳信息傳遞給下一代，使后代出現(xiàn)與親代相似的性狀。根據(jù)科學家已繪成的犬基因草圖，犬的基因數(shù)量與人和其他哺乳動物的大體一致，含有大約25億對DNA堿基。大約有幾萬個基因，儲存著生命孕育、生長、凋亡過程的全部信息，通過復制、表達、修飾，完成生命繁衍、細胞分裂和蛋白質(zhì)合成等重要生理過程。基因是生命的密碼，記錄和傳遞著遺傳信息。生物體的生、長、病、老、死等一切生命現(xiàn)象都與基因有關(guān)。

轉(zhuǎn)基因（Transgene）：所謂轉(zhuǎn)基因，是指運用科學手段從某種生物中提取所需要的基因，將其轉(zhuǎn)入另一種生物中與另一種生物的基因進行重組，從而產(chǎn)生特定的具有優(yōu)良遺傳性狀的物質(zhì)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以改變動植物性狀，培育新品種。也可以利用其它生物體培育出人類所需要的生物制品，用于醫(yī)藥、食品等方面。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgene technology）：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。人們常說的“遺傳工程”、“基因工程”、“遺傳轉(zhuǎn)化”均為轉(zhuǎn)基因的同義詞。經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾的生物體在媒體上常被稱為“遺傳修飾過的生物體”（Genetically modified organism，簡稱GMO）。通俗的講：轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是指利用分子生物學技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使遺傳物質(zhì)得到改造的生物在性狀和消費品質(zhì)等方面向人類需要的目標轉(zhuǎn)變。

幾種主要的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

世界上已報道了多種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法，主要有四類：第一類是融合法，包括精子載體法、微細胞介導融合等；第二類是化學法，包括DNA-磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色體介導法等；第三類是物理法，包括顯微注射法、電脈沖法、細胞凍存法等；第四類是病毒感染法，包括重組DNA病毒感染、重組RNA病毒感染等。但真正成熟并可以穩(wěn)定生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法主要有三種：即核顯微注射法、精子介導法和核移植法等基因轉(zhuǎn)移方法。基因打靶技術(shù)和胚胎干細胞（ES）介導技術(shù)是近年來新興的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，具有很好的發(fā)展前景。

核顯微注射法：核顯微注射技術(shù)是動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最常用的方法。它是指在顯微操作系統(tǒng)輔助下將外源基因注射到受精卵細胞的原核內(nèi)，注射的外源基因與胚胎基因組融合后，然后將胚胎進行體外培養(yǎng)，最后移植到受體母畜子宮內(nèi)發(fā)育，這樣分娩的動物體內(nèi)的每一個細胞都含有新的轉(zhuǎn)基因片段。這種方法的缺點是效率低、位置效應(yīng)(外源基因插入位點隨機性)造成的表達結(jié)果存在不確定性、動物利用率低等，在反芻動物還存在著繁殖周期長，有較強的時間限制、需要大量的供體和受體動物等特點。

精子介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)：精子介導的基因轉(zhuǎn)移是指把精子作適當處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后用攜帶有外源基因的精子給發(fā)情母畜授精。在母體所生的后代中，就有一定比例的動物是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。同顯微注射法相比，精子介導的基因轉(zhuǎn)移有兩個優(yōu)點：首先是它的成本很低，只有顯微注射法成本的1/10；其次，由于它不涉及進行動物處理，因此，可以用動物的生產(chǎn)群進行實驗，以保證每次實驗都能夠獲得成功。該方法是轉(zhuǎn)基因技術(shù)中非常有發(fā)展前途的一種方法，可以與體外受精、早期胚胎陽性選擇和胚胎超低溫保存技術(shù)相結(jié)合，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加實用化、簡單化。

核移植轉(zhuǎn)基因技術(shù)：體細胞核移植和轉(zhuǎn)基因相結(jié)合是近年來新出現(xiàn)并廣泛使用的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。該方法是先把外源基因?qū)氲焦w細胞內(nèi)，使外源基因整合到供體細胞染色體上，然后將供體細胞的細胞核移植到受體細胞——去核卵母細胞，構(gòu)成重建胚，再把其移植到同期發(fā)情的母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉(zhuǎn)基因的克隆動物。核移植轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有兩大優(yōu)點：第一，同一遺傳性狀供體核的數(shù)量可無限獲得；第二，可通過對供體細胞的遺傳改造，加速家畜品種改良或生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。

基因打靶技術(shù)：基因打靶技術(shù)是一項新興的分子生物學技術(shù)，包括去除致病或不利基因座位的基因敲除技術(shù)，以及將目的基因定點整合到基因組特定位點的基因敲入技術(shù)。該技術(shù)是利用外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合在預定位點上，從而改變細胞遺傳特性的方法，它的產(chǎn)生是遺傳工程領(lǐng)域的一次革命，為發(fā)育生物學、分子遺傳學、免疫學及醫(yī)學等學科提供了一個全新的、強有力的研究手段。目前基因打靶技術(shù)在研究基因的結(jié)構(gòu)和功能、表達與調(diào)控、轉(zhuǎn)基因及基因治療等方面均取得了進展，但基因打靶技術(shù)仍存在一些問題，主要是打靶的效率太低。

胚胎干細胞（ES）介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)：胚胎干細胞是指當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時內(nèi)細胞團的細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。

胚胎干細胞（ES）是早期胚胎經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)建立的多能性細胞系，在滋養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基中具有無限增值能力。從胚泡期胚胎內(nèi)的細胞群中分離細胞，培養(yǎng)并用外源基因進行轉(zhuǎn)染，外源基因通過隨機插入或同源重組的方式整合到ES細胞的基因組中。將轉(zhuǎn)入外源基因的ES細胞重新導入囊胚或進行克隆，可培育轉(zhuǎn)基因個體。這種技術(shù)稱為胚胎干細胞（ES）介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

ES細胞被公認為是最理想的受體細胞，是轉(zhuǎn)基因動物、細胞核移植、基因治療等研究領(lǐng)域的一種新的試驗材料，具有廣泛應(yīng)用前景。但ES細胞不易建株，在小鼠上應(yīng)用比較成功，而在其他大動物上的應(yīng)用尚處于探索階段。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)整體流程包括外源基因的克隆、表達載體構(gòu)建、受體細胞準備以及基因轉(zhuǎn)移等，外源基因的人工合成技術(shù)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的人工設(shè)計發(fā)展導致了21世紀的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將走向轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)生物技術(shù)——合成生物學時代。

轉(zhuǎn)基因犬的研究進展及其前景展望

2009年4月23日，英國《新科學家雜志》報道了韓國首爾國立大學李炳春(Byeong-Chun Lee)研究小組通過成纖維細胞克隆技術(shù)成功培育出5頭轉(zhuǎn)紅色熒光基因比格犬，這是世界上第一批轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄?頭比格犬在紫外光線下都呈現(xiàn)出紅色熒光。他們首次利用病毒載體將熒光基因?qū)氤衫w維細胞核內(nèi)，然后將這些成纖維細胞核移植到去核卵細胞內(nèi)。核移植胚胎經(jīng)過一周時間的體外培養(yǎng)后植入代孕母犬體內(nèi)。研究人員將344個晶胚卵細胞植入20頭犬體內(nèi)，最終7頭母犬成功懷孕。其后由于早期胚胎死亡及意外導致肺炎死亡。最終共有5頭比格犬存活下來，目前它們非常健康。

轉(zhuǎn)基因犬的問世，是動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一項重大突破。犬可以作為人類癌癥、失明等一系列疾病的動物模型，可通過對犬的基因序列改良來研究相關(guān)遺傳病的預防和治療?？茖W家認為：轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄茄芯咳藛T更好地理解人類疾病的一種潛在工具。美國列克星敦市肯塔基州立大學的康車民(音譯)認為：“這項最新研究將進一步開拓轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄谌祟惣膊⊙芯款I(lǐng)域中的應(yīng)用，下一步我們將培育用于治療人類疾病的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄??！泵绹固垢４髮W遺傳學家格雷格-巴什(Greg Barsh)將狗作為人類疾病的研究模型，他聲稱培育轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄且豁棥爸卮蠹夹g(shù)突破”，顯示克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于其他哺乳動物。

轉(zhuǎn)基因犬的研究成功，也有利于人類研究犬的生殖機理。美國科學家康車民（音譯）希望犬的轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠排除犬體內(nèi)特殊雌激素受體的影響，更好地理解犬繁殖時的激素效應(yīng)。他認為：犬擁有較長的壽命和生殖周期，在進行關(guān)于人類生殖的動物基礎(chǔ)實驗中，犬作為實驗體的優(yōu)勢要超過嚙齒類動物。這對于科學家們開展相關(guān)研究工作非常有用。

另一方面，轉(zhuǎn)基因犬的成功問世具有十分誘人的應(yīng)用前景。在未來，人們可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)提高工作犬的某些性能的美好愿望：比如，可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出嗅覺特別靈敏的超級作業(yè)犬，根據(jù)需要，培育出其它具有特殊本領(lǐng)的作業(yè)犬。同時，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可培育出抵抗某些特殊疾病的轉(zhuǎn)基因犬，諸如可抵抗狂犬病感染的轉(zhuǎn)基因犬，可抵抗犬瘟熱、犬細小病毒等病毒感染的轉(zhuǎn)基因犬等。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入研究和未來的不斷發(fā)展，還可以根據(jù)人們的需要，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育體大如牛的超大體型犬，也可培育出可放在手掌中玩耍的超小體型的玩具犬，可鉆到汽車或飛機“心臟”周圍進行安全檢查的微型工作犬，通過犬轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變?nèi)捏w形外貌毛色等，培育出符合我們理想的觀賞犬。

然而，轉(zhuǎn)基因研究是一項成本高昂，見效緩慢的研究。除了低成功率之外(韓國科學家首次研究中成功率僅1.7%)，擺在研究人員眼前的另一項挑戰(zhàn)就是轉(zhuǎn)基因的定點整合問題。李炳春研究小組使用一種逆轉(zhuǎn)錄酶病毒將熒光基因植入犬的成纖維細胞，但是他們無法控制這些病毒進入犬的基因組內(nèi)特定位置。這就很難避免培育出缺少特殊基因或基因變異的轉(zhuǎn)基因犬。

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)難題還比較多，目前實驗動物（如小鼠，大鼠和兔）的轉(zhuǎn)基因整合率僅為1%，而家畜（如牛、羊和豬）的整合率更低。而且外源基因容易從基因組中消失導致不能連續(xù)傳代。此外，外源基因表達不理想，同一個體的不同組織、不同個體的同一組織表達水平很不一致。轉(zhuǎn)基因可能給動物造成插入突變和機能紊亂。目前轉(zhuǎn)基因動物成活率很低，到目前為止，國內(nèi)外的轉(zhuǎn)基因動物幾乎有一半在出生后一周內(nèi)就會死亡，迄今原因不明。另外轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)品的安全性也是人們十分關(guān)注的一大問題。

（作者單位：公安部南昌警犬基地，330100）

（編輯：李 冰）