徐曉峰 周秀敏 張征宇 葛京平 周文泉程文 位志峰 侯健全 高建平

1. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210002；2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，△腫瘤科，江蘇 蘇州 215006

當(dāng)前在美國前列腺癌高居男性腫瘤發(fā)病的首位［1］，目前我國前列腺癌亦呈不斷上升的趨勢(shì)。內(nèi)分泌治療作為晚期前列腺癌主要的治療方法，但最終會(huì)因?yàn)榍傲邢侔┺D(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆詫?dǎo)致治療失?。?-3］。前列腺癌由雄激素依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆缘臋C(jī)制是目前前列腺癌研究的熱點(diǎn)。PAR（prostate androgen regulated）是新近發(fā)現(xiàn)的一種雄激素非依賴性前列腺癌特異性高表達(dá)的癌基因。已有研究提示PAR基因可能是與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有相關(guān)性［4］，但對(duì)于PAR基因高表達(dá)是否和雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的惡性表型相關(guān)，目前尚未見報(bào)道。本研究中采用RNA干擾技術(shù)抑制PAR基因在雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC3中的表達(dá)，觀察PC3細(xì)胞惡性表型的變化并初步研究其機(jī)制，從而更為深入地了解PAR基因的功能。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。質(zhì)粒psiRNA-hH1-neo購自InvivoGen公司。限制性內(nèi)切酶BbSⅠ購自Fermentas公司?？俁NA提取試劑TRIzol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司。高純度質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ShRNA表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建 從GenBank經(jīng)比對(duì)獲得人PAR基因（序列號(hào)為AF115850）序列，根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則，從起始密碼子下游100 nt后選取3個(gè)符合設(shè)計(jì)特征的靶序列，分別命名為PAR-a、PAR-b和PAR-c（表1）。用BLAST軟件進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)所選取的核苷酸序列與人體其他任何mRNA有同源性。

依據(jù)以上所選的序列設(shè)計(jì)3對(duì)53nt的寡核苷酸，相應(yīng)分別命名為PAR1、PAR2和PAR3。每條寡核苷酸兩端為帶有BbSⅠ酶切位點(diǎn)的序列，兩個(gè)20 nt反向互補(bǔ)排列的PAR特異性序列，中間由一個(gè)5 nt的間區(qū)隔開，轉(zhuǎn)錄后可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)（表2）。寡核苷酸由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 ShRNA靶向的PAR基因特異性位點(diǎn)Tab.1 ShRNA targeting regions of PAR gene

將合成的單鏈DNA經(jīng)退火處理獲得雙鏈結(jié)構(gòu)，插入已經(jīng)用BbSⅠ酶切處理過的線性質(zhì)粒psiRNA-hH1-neo中，構(gòu)建獲得重組體psiRNAPAR1、psiRNA-PAR2和psiRNA-PAR3，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，挑取生長(zhǎng)良好的克隆送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3在含10%小牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)傳代。將PC3細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%～70%時(shí)，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，具體操作按試劑說明書步驟進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組中每孔加入500 μL含有6 μL LipofectamineTM2000和2 μg質(zhì)粒的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立對(duì)照質(zhì)粒組。

表2 合成的53nt寡核苷酸Tab.2 Oligo nucleotides

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)PAR基因的表達(dá)采用 RT-PCR 篩選有效抑制PAR基因表達(dá)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染時(shí)間：轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，提取總RNA，以RNA反轉(zhuǎn)錄后合成的第一條cDNA鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PAR基因的引物序列，上游引物5’-GTCAGCAAGCACCTCAAAT-3’，下游引物5’-GAAGAAGATGGGGAAAAGG-3’；內(nèi)參照β-actin基因的引物，上游引物5’-GTGCCACCAGACAGCACTGTGTTG-3’；下游引物5’-TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3’。 PAR基因和β-actin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度分別為451 bp和202 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（共30個(gè)循環(huán)）；最后72 ℃ 延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，用Gelworks 1D Advanced v4.01軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.2.4 測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%的胰酶消化后，轉(zhuǎn)染前24 h以5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中。轉(zhuǎn)染后，每天取3個(gè)孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值，共7 d，繪制成生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 將約50 ℃、含0.6%瓊脂、10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 mL灌入直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，置于室溫待其凝固。將2 mL的50 ℃、含200個(gè)細(xì)胞、0.3%瓊脂和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液再均勻灌入入已鋪有底層培養(yǎng)基的60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)15 d，然后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)以上細(xì)胞的克隆，計(jì)算克隆形成率。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，計(jì)算平均值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞周期 用篩選獲得的抑制效應(yīng)最明顯的shRNA表達(dá)質(zhì)粒psiRNA-PAR1轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24和48 h后收集細(xì)胞，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次，再以500 μL PBS重懸細(xì)胞，加入-20 ℃預(yù)冷的85%乙醇溶液，4 ℃固定過夜。再用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入100 μL PC 緩沖液（phosphate-citric acid buffer）（0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L citric acid按192∶8的體積比混勻，pH值為7.8）室溫條件下避光處理20 min。再以PBS洗滌1次，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液500 μL（含10 μg/mL的PI和100 μg/mL的RNase A），避光，室溫條件下處理30 min后上機(jī)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞周期的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11.0行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 成功構(gòu)建獲得shRNA表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，針對(duì)PAR基因的3個(gè)特異性靶序列的寡核苷酸均成功插入psiRNA-hH1-neo質(zhì)粒，和設(shè)計(jì)序列完全一致。

2.2 轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)PC3細(xì)胞PAR mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示， PC3細(xì)胞中psiRNA-PAR1、psiRNAPAR2和psiRNA-PAR3對(duì)PAR mRNA的表達(dá)均有一定的抑制作用，其中以psiRNA-PAR1抑制效果最好，這3種表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒組相比平均抑制率分別為（81.18±1.68）%、（47.65±1.97）%和（5.25±0.59）%，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖1）。

在轉(zhuǎn)染48 h后，psiRNA-PAR1對(duì)PAR mRNA表達(dá)的抑制率達(dá)最高峰，為（81.18±1.68）%；而24和72 h時(shí)的抑制率分別為（28.96±3.95）%和（68.67±1.00）%，經(jīng)比對(duì)，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖2）。

2.3 轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，由生長(zhǎng)曲線結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染psiRNA-PAR1的細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢最明顯，相同時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)最少；轉(zhuǎn)染psiRNA-PAR2的細(xì)胞次之；轉(zhuǎn)染psiRNA-PAR3的細(xì)胞生長(zhǎng)減慢變化最小，這與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致（圖3）。

2.4 轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)PC3細(xì)胞克隆形成能力的影響 軟瓊脂克隆檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒psiRNA-PAR1、psiRNA-PAR2和psiRNA-PAR3的PC3細(xì)胞的克隆形成率分別為0、2%和48%，與轉(zhuǎn)染空載體組的62%和空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）的68%相比較，明顯降低（P<0.05），尤其是psiRNA-PAR1組的細(xì)胞克隆形成能力幾乎喪失。

圖3 轉(zhuǎn)染shRNA后PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of PC3 cells after transfected with shRNA

2.5 細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞周期變化 FCM法檢測(cè)結(jié)果提示，shRNA 轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞24和48h時(shí)，對(duì)照組處于G2/M期的細(xì)胞分別為（21.39±1.39）%和（23.79±3.16）%，凋亡率分別為（0.30±0.04）%和（1.49±0.13）%；而 psiRNA-PAR1組處于G2/M期的細(xì)胞分別為（39.32±1.56）%和（29.95±3.25）%，凋亡率分別為（12.16±1.18）%和（20.61±2.73）%，與對(duì)照組相比，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，表3，圖4），說明轉(zhuǎn)染psiRNAPAR1對(duì)PC3細(xì)胞有明顯的細(xì)胞周期阻滯作用，使細(xì)胞阻滯在G2/M期，并誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表3 psiRNA-PAR1轉(zhuǎn)染對(duì)PC3細(xì)胞周期和凋亡的影響Tab.3 The effects of siRNA on cell cycle and apoptosis of PC3 cells( )

表3 psiRNA-PAR1轉(zhuǎn)染對(duì)PC3細(xì)胞周期和凋亡的影響Tab.3 The effects of siRNA on cell cycle and apoptosis of PC3 cells( )

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圖4 psiRNA-PAR1轉(zhuǎn)染對(duì)PC3細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effects of siRNA on cell cycle and apoptosis of PC3 cells

3 討 論

臨床研究結(jié)果顯示，在晚期前列腺癌內(nèi)分泌治療過程中癌細(xì)胞出現(xiàn)雄激素非依賴性是治療失敗的主要原因［8］。近年來，人們?cè)诜肿铀綄?duì)雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療進(jìn)行了大量的研究，不斷尋找新的致癌基因并作為其潛在的分子靶點(diǎn)［9-10］，而其中具有前列腺癌組織特異性的致癌基因更有研究?jī)r(jià)值［4-5］。

新近發(fā)現(xiàn)的在前列腺癌中表達(dá)異常的PAR基因位于人1號(hào)染色體上，片段長(zhǎng)度為1 038 bp，編碼146個(gè)氨基酸，其在正常的前列腺組織和癌組織中均有表達(dá)，但大約67%標(biāo)本中，癌組織中有更高的表達(dá)；PAR在LNCaP、DU145、PC3和LNCaP-OM等前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)也比正常的前列腺上皮細(xì)胞要高；而在雄激素非依賴性細(xì)胞系DU145、PC3和LNCaPOM中的表達(dá)明顯高于雄激素依賴性細(xì)胞系LNCaP。雄激素可以使雄激素依賴性細(xì)胞系的PAR表達(dá)下調(diào)，而對(duì)雄激素非依賴性細(xì)胞系的PAR表達(dá)則無抑制作用［6］。Platica等［7］將PAR cDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞NIH3T3，使其獲得惡性表型，但抑制PAR基因在雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)是否會(huì)使其惡性表型逆轉(zhuǎn)，目前尚無相關(guān)研究報(bào)道。

RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)的作用機(jī)制是：以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)，通過活化的21～23 nt的小片段干擾RNA（siRNA），降解特定的mRNA，使目的基因表達(dá)下調(diào)。siRNA作用的高效性、特異性和 穩(wěn)定性均優(yōu)于反義核酸和核酶等反義技術(shù)［11］。本實(shí)驗(yàn)采用了psiRNA-hH1-neo質(zhì)粒系統(tǒng)，成功構(gòu)建了針對(duì)PAR基因3個(gè)不同位點(diǎn)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，通過抑制PAR基因的表達(dá)研究其功能。轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒的PC3細(xì)胞系與對(duì)照組相比，PAR基因的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，提示RNAi技術(shù)可以有效抑制PAR的表達(dá)，有望作為前列腺癌基因治療的有效手段。本研究利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明PAR表達(dá)下調(diào)可明顯抑制PC3細(xì)胞惡性增殖。為探討細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的機(jī)制，進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PAR基因的mRNA表達(dá)下調(diào)能夠明顯引起PC3細(xì)胞阻滯于G2/M期，凋亡增加。G2/M期檢查點(diǎn)是細(xì)胞存活和死亡的重要決定點(diǎn)，細(xì)胞經(jīng)過此點(diǎn)即進(jìn)入分裂期［12-13］。下調(diào)PAR基因的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，其主要機(jī)制可能是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡。這一結(jié)果提示PAR基因可能參與前列腺癌的惡性轉(zhuǎn)化，PAR基因可能是一個(gè)新的與雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞惡性增殖密切相關(guān)的癌基因，有望作為今后前列腺癌基因治療的有效靶點(diǎn)之一。

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