凌暉 朱亞平 劉芳 李艷蘭 文玲 蘇琦

南華大學(xué)腫瘤研究所，病理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001

生物體內(nèi)存在復(fù)雜的細(xì)胞周期檢測點(diǎn)信號網(wǎng)絡(luò)途徑，由感受器（Rad9-Rad1-Hus1復(fù)合體、Rad17等）、信號傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器［細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶（checkpoint kinase，Chk，如Chk1、Chk2等）］等構(gòu)成［1］。Chk1是生物進(jìn)化過程中非常保守的一種蛋白激酶，在細(xì)胞周期檢測點(diǎn)調(diào)節(jié)中有著非常重要的作用，其在人體多種正常組織和腫瘤組織中均有表達(dá)，并可能與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［2］。研究表明，Chk1缺失的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出多重缺陷如：細(xì)胞增殖緩慢、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的阻滯反應(yīng)消失和對DNA損傷劑的敏感性增加等［3-4］。由于細(xì)胞周期與腫瘤間的密切關(guān)系，Chk1與腫瘤的關(guān)系及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用也成為目前研究的熱點(diǎn)之一。為探索Chk1在人類腫瘤細(xì)胞中對生長增殖活性和細(xì)胞周期的調(diào)控作用，本研究通過RNA干擾技術(shù)將人胃癌BGC823細(xì)胞中的Chk1基因沉默，阻斷細(xì)胞周期檢查點(diǎn)信號傳導(dǎo)通路，觀察其對人胃癌BGC823細(xì)胞生長及周期的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司。siRNA轉(zhuǎn)染試劑、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液及Chk1 siRNA（基因序列為5’-AAGTTCAACTTGCTGTGAATA-3’）、LipofectamineTM2000為Santa Cruz公司產(chǎn)品。Bradford試劑購于上海生功生物工程有限公司。Chk1（兔抗人多克隆抗體）及相應(yīng)二抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。β-actin購自武漢博士德公司（兔抗人多克隆抗體）。電化學(xué)發(fā)光劑Lumi-GLO Reagant是CST公司產(chǎn)品。碘化丙啶（PI）購自Sigma公司。

1.2 BGC823細(xì)胞的培養(yǎng) 人胃癌BGC823細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，系人胃低分化腺癌。常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、恒濕、恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 RNA干擾實(shí)驗(yàn) siRNA的配制及脂質(zhì)體復(fù)合體合成：5 nmol的Chk1 siRNA用無核酸酶水稀釋，終濃度為20 μmol/L。將干擾用的適量siRNA稀釋于siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液中，輕輕混勻。適量的LipofectamineTM2000與稀釋的siRNAs混合，輕輕混勻，并于室溫下溫育20 min左右，制備獲得siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合體。

siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1 d將對數(shù)生長期的細(xì)胞以3×105個/孔接種于6孔板中，細(xì)胞鋪板在2 mL含血清、不含抗生素的正常培養(yǎng)基中，于24 h內(nèi)當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)40%～60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在加入復(fù)合物前換用1 mL無血清、無抗生素的培養(yǎng)液后將脂質(zhì)體復(fù)合體加到培養(yǎng)板中，按轉(zhuǎn)染試劑說明書分別予50、100、150 μmol/L的Chk1 siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮的含血清、不含抗生素的正常培養(yǎng)液2.5 mL，實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和轉(zhuǎn)染組3組，其中未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體組作為對照。

1.4 Western blot檢測 細(xì)胞裂解，收集蛋白質(zhì)，Bradford法測定含量。蛋白變性后每孔上樣30 μg，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST（Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L和0.1%Tween-20）室溫封閉1 h，用Chk1、β-actin 4 ℃過夜，TBST洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的二抗室溫溫育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層色譜掃描儀（日本公司生產(chǎn)，型號CS-930）測定印跡區(qū)帶的灰度值。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthi ahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，是一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570 nm處進(jìn)行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度A值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會有反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)常規(guī)胰酶消化后收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×105個，接種100 μL于96孔平底培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后加入20 μL 5 mg/mL MTT/PBS液培養(yǎng)6 h即終止培養(yǎng)，以DMSO溶解甲簪，振搖10 min，置酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長570處的A值（取6復(fù)孔）。抑制率（inhibition rate，IR）按公式計(jì)算： IR（%）=（1-A570實(shí)驗(yàn)組/A570對照組）×100%

1.6 流式細(xì)胞儀分析 收集轉(zhuǎn)染24和48 h的培養(yǎng)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，再用4 ℃預(yù)冷的75%乙醇溶液固定48 h，1 000×g離心10 min，棄上清液，1 000 μL PBS重懸加0.5 mg/mL RNase50 μL，混勻，37 ℃水浴30 min，PBS洗去RNase，100 μL PBS重懸，加1 mg/mL碘化丙啶（PI）50 μL，振蕩混勻，4 ℃避光染色30 min。流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度，CellQuest分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析，確定細(xì)胞周期分布。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 11.5.2.1統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行Student’s t-test法分析，數(shù)值用表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Chk1 siRNA轉(zhuǎn)染后Chk1在BGC823細(xì)胞的表達(dá) Western blot測結(jié)果顯示（圖1），轉(zhuǎn)染靶向Chk1 siRNA 24 h的Chk1蛋白雜交帶，其相對灰度值為0.11±0.08，明顯低于未轉(zhuǎn)染組的0.66±0.21、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的0.70±0.25（P<0.05），而未轉(zhuǎn)染對照組與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Chk1的蛋白表達(dá)下調(diào)了83.1%。這證實(shí)了轉(zhuǎn)染靶向Chk1 siRNA抑制Chk1蛋白的表達(dá)。

2.2 Chk1siRNA轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖的影響在確保Chk1基因被有效沉默后，本研究針對Chk1蛋白表達(dá)缺失情況下的細(xì)胞，采取MTT法檢測其增殖活性的變化。對siChk1轉(zhuǎn)染48 h的BGC823細(xì)胞進(jìn)行MTT 檢測。相比未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，Chk1基因沉默后的BGC823細(xì)胞增殖活性明顯下降，生長受到抑制。細(xì)胞增殖活性在100 μmol/L轉(zhuǎn)染后48 h 其吸光度（A570）為0.41±0.04，明顯低于為未轉(zhuǎn)染組的0.79±0.05和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的0.82±0.07（P<0.05）（表1）。50 μmol/L siChk1對細(xì)胞生長有一定抑制作用，隨濃度增加抑制率也增加，100 μmol/L時抑制率為48.1%，100、150 μmol/L濃度組對細(xì)胞的抑制率無明顯差異。這些發(fā)現(xiàn)揭示一定水平的Chk1蛋白的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖活動所必需的。

表1 100 μmol/L siChk1轉(zhuǎn)染后BGC823細(xì)胞48 h的A570 值Tab.1 The A570 values of BGC823 cells after siChk1 transfection within 48 h( , n=6)

表1 100 μmol/L siChk1轉(zhuǎn)染后BGC823細(xì)胞48 h的A570 值Tab.1 The A570 values of BGC823 cells after siChk1 transfection within 48 h( , n=6)

*: P＜0.05 vs untransfected control.

2.3 Chk1siRNA轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞周期的影響 為了進(jìn)一步探討這種細(xì)胞生長變緩是否與細(xì)胞周期的改變有關(guān)，本研究采用了流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）的方法，檢測了Chk1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞處于不同時期的比例變化，對siChk1轉(zhuǎn)染24、48 h后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，與未轉(zhuǎn)染組相比，經(jīng)過Chk1 siRNA作用后細(xì)胞比例在G0/G1期由未轉(zhuǎn)染組的（48.3±1.1）%、（50.2±1.9）%增加至（63.9±1.7）%、（66.1±2.3）%（P<0.05），S期和G2/M期減少，增殖指數(shù)（proliferating index，PI）由51.7%和49.8%減少至36.2%和34.4%（表2，圖2）。

圖1 Chk1 SiRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞后Chk1蛋白表達(dá)的改變Fig.1 Expressions of Chk1 protein in BGC823 cells after transfection with Chk1 siRNA

圖2 Chk1 siRNA干擾對BGC823細(xì)胞周期的影響Fig.2 The effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells

表2 Chk1 siRNA干擾前后BGC823細(xì)胞周期的變化Tab.2 Effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells( , n=6)

表2 Chk1 siRNA干擾前后BGC823細(xì)胞周期的變化Tab.2 Effect of Chk1 gene silence on the cell cycle percentage of BGC823 cells( , n=6)

*: P＜0.05 vs untransfected group.

3 討 論

腫瘤發(fā)生的根本原因在于本應(yīng)停止增殖或生理性凋亡的細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。細(xì)胞通過調(diào)控cyclin、CDK、CKI和Chk1等基因的有序表達(dá)實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期進(jìn)展速度的調(diào)控［5］。檢查點(diǎn)激酶Chk1是非常重要的細(xì)胞周期檢測點(diǎn)調(diào)節(jié)蛋白，其蛋白的穩(wěn)定表達(dá)有利于維護(hù)DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期檢測點(diǎn)調(diào)節(jié)，以保證細(xì)胞基因組的完整和穩(wěn)定［1］。在臨床上由于腫瘤細(xì)胞在化療中逃避凋亡，許多通過損傷DNA使細(xì)胞凋亡的癌癥治療方案在療效上十分有限， 而細(xì)胞逃避凋亡與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的活化有關(guān)，因而有研究者試圖通過抑制細(xì)胞周期檢測點(diǎn)來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，Chk1的研究為癌癥的治療帶來了契機(jī)［6-8］。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使胃癌細(xì)胞株BGC823的Chk1基因沉默，旨在探討抑制細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶Chk1對人胃癌細(xì)胞株BGC823增殖與細(xì)胞周期的影響。

本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)觀察了Chk1 siRNA轉(zhuǎn)染對BGC823細(xì)胞Chk1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，將Chk1基因沉默后，通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Chk1蛋白水下降明顯，表明靶向Chk1 siRNA產(chǎn)生了序列特異性效果。在確保Chk1基因被有效沉默后，本研究針對Chk1蛋白表達(dá)缺失情況下的細(xì)胞，采取MTT法評價其增殖活性的變化。結(jié)果顯示，相比未轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，Chk1基因沉默后的BGC823細(xì)胞增殖活性明顯下降，生長受到抑制。這些發(fā)現(xiàn)揭示一定水平的Chk1蛋白的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖活動所必需的。本研究還發(fā)現(xiàn)，Chk1 siRNA沉默目的基因?qū)?xì)胞周期產(chǎn)生了顯著影響，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。Chk1表達(dá)的下調(diào)影響細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與G0/G1期阻滯作用相關(guān)。

Chkl參與G1/S檢測點(diǎn)調(diào)控，G1/S 檢測點(diǎn)阻止細(xì)胞進(jìn)入S狀態(tài)，當(dāng)DNA受到損害不能進(jìn)行復(fù)制時這種阻止就開始發(fā)生，為了適應(yīng) DNA的損害，G0/G1阻滯作用通過Chk1路徑快速地發(fā)生［9］。本研究結(jié)果證實(shí)，Chk1表達(dá)下調(diào)可能通過誘導(dǎo)G0/G1期阻滯來抑制人胃癌BGC823細(xì)胞增殖，其具體分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，Chk1對人胃癌細(xì)胞生長和增殖起著重要的調(diào)控作用。Chk1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性顯著下降，細(xì)胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，生長受抑。揭示Chk1蛋白可能直接或間接地參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控。

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