石 燕，姜金斗，劉 寧,*

（1.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱 150086）

隨著人們生活水平的不斷提高，鮮乳的消費(fèi)量日漸增加，在歐洲，綿羊乳和山羊乳的飲用已經(jīng)有千年的歷史，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。奶山羊是人類的三大奶源之一，是羊乳的主要來(lái)源，被譽(yù)為“不用冰箱的奶庫(kù)”和“貧民的奶牛和聚寶盆”[2]。近些年，由于羊乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊乳需求量的增大，摻假行為屢有發(fā)生。出現(xiàn)這種摻假行為的原因有：綿羊和山羊乳產(chǎn)量不高，季節(jié)性波動(dòng)大，并且價(jià)格較貴；國(guó)外不法企業(yè)將產(chǎn)量過(guò)剩的牛乳摻入羊乳，以減少損失[3]。而在我國(guó)，一些不法分子為了追求高額利潤(rùn)，在牛乳中摻入價(jià)格相對(duì)低廉的山羊乳，嚴(yán)重影響了牛乳的口感與質(zhì)量，也影響到了一些以鮮乳為原料的干酪制品的質(zhì)量[4]，使乳制品生產(chǎn)廠家蒙受巨大損失。因此，混合乳檢測(cè)方法的確立，是食品檢驗(yàn)和執(zhí)法部門當(dāng)前所面臨的重要問(wèn)題。

目前毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CE）測(cè)定羊乳中摻入牛乳已有報(bào)道，主要以乳清蛋白的分析為基礎(chǔ)，有研究用毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）的方法檢測(cè)羊乳中摻入的牛乳量，根據(jù)所測(cè)的不同乳中的β-乳球蛋白（β-LG）的峰值進(jìn)行定量檢測(cè)[3]。Bramanti等利用高效液相色譜（HPLC）分析 αs1/κ、αs2/β、β/κ和αs2/αs1，這些酪蛋白的峰面積值可作為羊乳中摻入牛乳的檢測(cè)指標(biāo)[5]。HPLC同大多數(shù)定性定量分析乳中蛋白質(zhì)的方法一樣，要求首先把乳清蛋白和酪蛋白分離開，再進(jìn)行分析，而毛細(xì)管電泳則不需要此過(guò)程，因此它可以提供一種快速、高分辨率、良好量化并適合于各種混有乳產(chǎn)品的分析手段[6-7]。

通過(guò)參考并比較國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究文章，本文采用毛細(xì)管電泳法研究了混合乳中的蛋白，選取特定酪蛋白的遷移時(shí)間做定性研究，根據(jù)特定酪蛋白峰面積的比值做定量研究，建立混合乳的定性定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

新鮮牛乳、山羊乳（采自八五二農(nóng)場(chǎng)）；5種乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自Sigma公司）；檸檬酸（購(gòu)自天津東麗化學(xué)試劑公司）；檸檬酸鈉（購(gòu)自天津凱通化學(xué)試劑公司）；羥丙基甲基纖維素（HPMC）（購(gòu)自山東瑞泰化工）；氨基丁三醇（Tris）（購(gòu)自Sigma公司）；3-（N 嗎啉）-2-羥基丙磺酸（MOPOS）（購(gòu)自索來(lái)寶公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（購(gòu)自Sigma公司）；二硫代蘇糖醇（DTT）（購(gòu)自Sigma公司）；尿素（購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑公司）。

1.1.2 儀器

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀，配有紫外檢測(cè)器，美國(guó)Beckman公司；聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管；60 cm×50 μm i.d.美國(guó) Beckman 公司；臺(tái)式離心機(jī)TCL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠；DELTA320 pH計(jì)，梅特勒-托利多公司；超純水儀，美國(guó)MILLPORE公司。

1.2 方法

1.2.1 緩沖溶液的配制[8]

電泳緩沖液：0.32 mol·L-1檸檬酸，20 mmol·L-1檸檬酸鈉，6 mol·L-1尿素，0.05%HPMC，調(diào)節(jié)pH到3.0，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

樣品緩沖液：用 167 mmol·L-1Tris、42 mmol·L-1MOPOS、67 mmol·L-1EDTA 鈉鹽、17 mmol·L-1DTT、6 mol·L-1尿素和 0.5 g·L-1HPMC，調(diào)節(jié) pH 到 8.6，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.2 樣品處理[9]

原料乳：將鮮乳與樣品緩沖溶液按1：4 V/V的比例混合，室溫下放置1 h，10 000 r·min-1離心5 min，取中間澄清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

混合乳：各取新鮮牛乳、山羊乳分別按體積比10： 90、 20： 80、 30： 70、 40： 60、 50： 50、 60： 40、70： 30、80：20 和 90： 10 的比例混合，然后將混合溶液與樣品緩沖液按1：4 V/V的比例混合，室溫下放置1 h， 10 000 r·min-1離心5 min，取中間澄清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白：用樣品緩沖液將α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和 κ-酪蛋白（κ-CN）分別配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

儀器操作條件：壓力進(jìn)樣：0.5 psi，5 s，柱溫25℃，分離電壓為25 KV，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。進(jìn)樣前和樣品間沖洗程序：0.1 mol·L-1HCl沖洗2 min，超純水沖洗2 min，電泳緩沖液沖洗5 min。

1.2.3 分析指標(biāo)

根據(jù)混合乳中各酪蛋白的遷移時(shí)間作為定性檢測(cè)指標(biāo)，且滿足分析條件的遷移時(shí)間和峰面積的RSD＜5%。根據(jù)選定的酪蛋白峰面積之間的比值作為定量檢測(cè)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳和山羊乳混合乳的研究

2.1.1 不同物種間乳的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜

測(cè)定牛乳和山羊乳中蛋白質(zhì)得到的電泳圖譜如圖1所示。通過(guò)對(duì)照牛乳中各個(gè)乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品的遷移時(shí)間，可定性明確其中的主要乳蛋白成分，如圖1b所示。參考Jose等研究的山羊乳中的蛋白遷移時(shí)間及順序，根據(jù)本研究結(jié)果可明確該山羊乳樣品中的主要蛋白成分，如圖1a所示[8,10]。根據(jù)遷移時(shí)間的不同，能夠明顯看出兩種原料乳中的蛋白成分不同，表明山羊乳與牛乳所含蛋白成分有很大差別。另外，該實(shí)驗(yàn)方法能夠使乳中所含的各種蛋白成分得到較好的分離，且圖譜清晰明了。

利用酪蛋白片段遷移時(shí)間的不同作為檢測(cè)指標(biāo)。由圖1可知，不同乳中酪蛋白遷移順序相同：牛乳酪蛋白：αs2-CN＜αs1-CN＜αs0-CN＜κ-CN＜βcasein A1＜β-casein A2；羊乳酪蛋白：αs2-CN＜αs1-CN＜κ-CN＜β2-CN＜β1-CN。但遷移時(shí)間不同。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)不同品種乳的αs0-CN、αs1-CN、κ-CN和β-CN等的遷移時(shí)間明顯不同，因此選取了牛乳的αs1-CN、αs0-CN、κ-CN、β-casein A1和山羊乳的β-CN、β1-casein來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖1 乳蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳Fig.1 Capillary electropherogram of milk protein

2.2 混合乳的定性檢測(cè)

將混合比例為50：50（V/V）的牛乳和山羊乳混合樣品進(jìn)樣分析，得到混合乳的電泳圖譜如圖2所示。連續(xù)進(jìn)樣10次，根據(jù)電泳圖計(jì)算各酪蛋白片段遷移時(shí)間和峰面積的平均值以及它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。并從中選出遷移時(shí)間和峰面積的RSD較小值對(duì)應(yīng)的酪蛋白作為定性鑒定的酪蛋白。

圖2 混合乳的毛細(xì)管區(qū)帶電泳Fig.2 Capillary electropherogram of milk mixture

由表1可知，所測(cè)的遷移時(shí)間的RSD值中，牛乳的αs0-CN、β-CN A1和山羊乳中的β-CN、β1-CN所得的值相對(duì)較?。欢鄬?duì)峰面積的RSD值中，牛乳的αs1-CN、β-CN A1和山羊乳的β-CN、β1-CN相對(duì)較小，而牛乳的κ-CN和αs0-CN的相對(duì)峰面積的RSD較高。各酪蛋白的遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于5%，表明選擇的酪蛋白片段的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，這些酪蛋白均可以作為定性檢測(cè)混合乳的特定酪蛋白。

2.3 混合乳的定量檢測(cè)

綜合考慮上述所得結(jié)果，排除峰值較小的牛乳中的κ-CN和αs0-CN，選定牛乳αs1-CN、β-CN A1和山羊乳β-CN、β1-CN做定量研究。將配制成不同比例的混合乳樣品進(jìn)樣分析，計(jì)算不同酪蛋白的峰面積之間的比值，并考察各酪蛋白峰面積比值與混合乳比例是否呈線性相關(guān)性，結(jié)果見表2。

表1 混合乳中酪蛋白遷移時(shí)間、相對(duì)峰面積平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）Table 1 Mean and relative standard deviation of the migration times and the relative peak areas of the caseins in milk mixture(n=10)

表2 酪蛋白峰面積比值及檢測(cè)限Table 2 Ration of different casein peak area and the detection limit of mixed milk

混合乳中的牛乳αs1-CN和山羊乳β1-CN峰面積比值與牛乳百分含量的關(guān)系如圖3所示，以混合乳中牛乳的百分含量為橫坐標(biāo)，以αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）峰面積的比值為縱坐標(biāo)做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，由圖3可見線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.9973。

混合乳中的牛乳β-CN A1和山羊乳β-CN峰面積比值與牛乳百分含量的關(guān)系如圖4所示，以混合乳中牛乳的百分含量為橫坐標(biāo)，以β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）峰面積的比值為縱坐標(biāo)做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，由圖4可見線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.998。

由表2所列數(shù)據(jù)和圖3和圖4所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知 αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）和 β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）的峰面積比值與混合乳的比例存在著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997，因此αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）和β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）的峰面積比值可以作為混合乳的定量檢測(cè)指標(biāo)。牛乳的檢測(cè)限分別能達(dá)到2%和3%。

圖3 牛乳αS1-CN和山羊乳β1－CN峰面積比值與牛乳的百分量的線性關(guān)系Fig.3 Linear correlation of peak areas on cow's casein αS1-CN and goat's casein β1－CN with cow's milk contents

圖4 牛乳β－CN A1與山羊乳β－CN峰面積比值與牛乳的百分量的線性關(guān)系Fig.4 Linear correlation of peak areas on cow's casein β－CN A1and goat's casein β－CN with cow's milk contents

3 討論

a.選取涂層毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分析了不同物種間的乳蛋白，由于毛細(xì)管電泳技術(shù)具有高效和明顯減少溶劑浪費(fèi)等特點(diǎn)，加速了乳品質(zhì)量快速檢測(cè)和自動(dòng)化分析的進(jìn)程[11-13]。因此選擇毛細(xì)管電泳方法來(lái)測(cè)定混合乳中的蛋白比其他檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)。由于毛細(xì)管電泳中蛋白質(zhì)對(duì)管壁有較強(qiáng)的吸附作用，影響分離效率，常會(huì)出現(xiàn)峰高降低甚至不出峰的現(xiàn)象，蛋白質(zhì)吸附同時(shí)引起電滲流的變化和分離效率顯著降低，所以蛋白質(zhì)分離首要解決的問(wèn)題就是吸附問(wèn)題，本文選擇的聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管柱可有效的抑制管壁對(duì)蛋白的吸附，得到較好的分離效果[14]。本研究中各主要蛋白均得到基線分離，證明該方法分離效果較好。根據(jù)不同乳的蛋白遷移時(shí)間可以區(qū)別不同物種乳之間的乳蛋白成分。

b.測(cè)定羊乳中摻入牛乳的研究已有報(bào)道，主要是以乳清蛋白的定量分析為基礎(chǔ)。毛細(xì)管區(qū)帶電泳測(cè)得牛乳含量在0～20%的范圍內(nèi)時(shí)，牛乳β-乳球蛋白和羊乳α-乳白蛋白的峰面積比率與牛乳含量線性相關(guān)[15]；反相高效液相色譜分析乳清蛋白適合于常規(guī)檢測(cè)，但是同時(shí)乳清蛋白存在遺傳變異和熱不穩(wěn)定等方面的限制，某些色譜圖譜十分復(fù)雜，分析困難，有些情況下檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。而本文得到的乳蛋白電泳圖中酪蛋白較豐富，因此本文選取乳中的酪蛋白作為檢測(cè)指標(biāo)。與以乳清蛋白為檢測(cè)指標(biāo)的研究相比較，本文可選的檢測(cè)指標(biāo)范圍更廣，線性結(jié)果較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。

c.利用乳酪蛋白遷移時(shí)間的不同來(lái)定性檢測(cè)混合乳，但從混合乳蛋白電泳圖中能夠明顯看出有的蛋白峰減小甚至消失，而有的蛋白峰增大。減小的蛋白峰如牛乳的αs2-CN和山羊乳的αs2-CN，可能是由于各自進(jìn)樣量的減小，峰型不好，不能選擇其作為定性酪蛋白。而牛乳中的β-CN A2和山羊乳中的β2-CN峰重疊，使得混合乳的電泳圖中該位置的峰有所增大，也不能選擇這兩種酪蛋白作為定性酪蛋白。綜合分析，選擇能夠明顯區(qū)分不同物種間且峰型較好的酪蛋白作為定性鑒定的酪蛋白，與利用高效液相色譜研究分析所選的α1-、α2-、β-和κ-casein[5]相比，本研究中選取的酪蛋白包括β-CN亞型，如β1-CN和β-CN A1，酪蛋白峰更加具體，且各種酪蛋白相對(duì)遷移時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，均可以作為定性鑒定的酪蛋白。選擇穩(wěn)定性和重現(xiàn)性相對(duì)較好的牛乳中的αs1-CN、β-CN A1和山羊乳的β-CN、β1-CN做定性研究，結(jié)果表明 αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）、β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）可以作為混合乳的定量檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果可靠。

本研究結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、快速、無(wú)污染，為乳的質(zhì)量監(jiān)控提供了一個(gè)新的途徑，對(duì)乳品產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)采用涂層毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法測(cè)得的混合乳中的蛋白成分，較好的分離各種乳酪蛋白分離效果較好，得到的電泳圖譜清晰明了，且該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。研究選取擇了穩(wěn)定性好的牛乳 αs1-CN、αs0-CN、κ-CN、β-CN A1和山羊乳的β-CN、β1-CN作為定性檢測(cè)混合乳的摻假特定酪蛋白，根據(jù)混合乳的不同混合比例與特定酪蛋白 αs1-CN/（β1-CN+αs1-CN）、β-CN A1/（β-CN+β-CN A1）峰面積的比值之間存在著良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)均大于0.997，可以作為定量檢測(cè)混合乳摻假的指標(biāo)。

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