冀 宏，劉 萍，朱 清，姚璐曄，徐 兵

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

白背毛木耳 （Auricularia polytricha）隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬中的毛木耳種[1]。毛木耳為著名的食藥兼用真菌，質(zhì)脆滑爽，被譽(yù)為 “樹上海蜇皮”，目前國內(nèi)和東南亞市場需求與日俱增。國內(nèi)白背毛木耳栽培技術(shù)和品種均源自臺灣省，由于種質(zhì)單一，經(jīng)過多年的生產(chǎn)，菌種呈現(xiàn)性狀退化趨勢，加快選育優(yōu)良性狀新品種是相關(guān)技術(shù)研究所關(guān)注的主要方向[2，3]。對異宗結(jié)合食用菌來說，目前育種研究應(yīng)用普遍，同時也最具成效的方法是雜交育種技術(shù)，經(jīng)過有性繁育培養(yǎng)的菌種，則有可能在各方面表現(xiàn)出優(yōu)于親本的良好性狀[4－7]。該技術(shù)的關(guān)鍵是有性單孢子收集和雜交子鑒定。白背毛木耳是異宗結(jié)合的四極性菌類，每個擔(dān)子上通常有4個擔(dān)孢子[1]，通過試驗(yàn)可以獲得毛木耳有性單孢子[8]。同工酶分析作為化學(xué)分類的重要指標(biāo)應(yīng)用于真菌的分類鑒定中，是菌株分類鑒定和親緣關(guān)系研究的重要手段。酯酶是一種食用菌中存在較普遍的酶，其同工酶譜又具有較高的多型性，因而特別適于作為雜種鑒定的指標(biāo)[9]。采用酯酶同工酶分析鑒定毛木耳雜交子是最為真實(shí)可靠的方法。

白背毛木耳生產(chǎn)已成為江蘇省豐縣農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的特色產(chǎn)業(yè)。由于生產(chǎn)模式粗放，近年來菌種退化嚴(yán)重。本研究旨在通過單孢子收集、菌絲體融合、酯酶同工酶分析的雜交育種方法，對產(chǎn)區(qū)主打生產(chǎn)品種 “豐2”進(jìn)行優(yōu)化改良，獲得更加適合當(dāng)?shù)刭Y源環(huán)境條件的性狀優(yōu)良的雜交子，為白背毛木耳區(qū)劃良種選育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試品種

江蘇豐縣師寨鎮(zhèn)白背毛木耳產(chǎn)區(qū)主流品種 “豐2”。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、牛肉膏、維生素B1、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、過硫酸銨、蔗糖、Tris、TEMED、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Acr、Bis、甘氨酸、乙酸－1－萘酯、乙酸－2－萘酯、固蘭RR鹽、丙酮、乙酸、溴酚藍(lán)，上述試劑均為分析純，由中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司提供。豆粕、麥麩、玉米粉、馬鈴薯等為市購。

酯酶同工酶電泳的試劑配制參照NY－T 1097－2006[7]。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基： 馬鈴 薯 20 g·100－1·mL－1、 葡萄 糖 2 g·100－1·mL－1、 瓊脂 2 g·100－1·mL－1， pH 自然液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 20 g·100－1·mL－1、 玉米粉 3 g·100－1·mL－1、 葡萄糖 2 g·100－1·mL－1、 蛋白胨 0.2 g·100－1·mL－1、 磷酸二氫鉀 0.2 g·100－1·mL－1、 硫酸鎂 0.1 g·100－1·mL－1、 維生素 B1（10 mg·100－1·mL－1）、 酵母粉 0.5 g·100－1·mL－1， pH 自然

栽培培養(yǎng)基 （木屑麥麩培養(yǎng)基）：木屑73%、麥麩25%、糖1%、碳酸鈣1%，含水量65%。

1.2 儀器與設(shè)備

EL104電子天平，梅特勒－托利多上海儀器有限公司；S－SW－CJ－2F超凈工作臺，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HYG－A全溫?fù)u瓶柜，太倉市博萊特儀器廠；303型智能人工氣候培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡，江南光電股份有限公司；3K30高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；1000μL移液槍，英國吉爾森公司；DYCZ－24DN型垂直板電泳槽，北京六一儀器公司；顯微鏡圖像分析系統(tǒng)，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子收集

采用鉤懸法收集單孢子。方法如下：無菌操作將耳片用無菌水洗滌，無菌紗布吸干，切成大小合適 （以不碰觸三角瓶口、壁為宜）的塊狀，取滅菌回形針，一端鉤住耳片，另一端鉤在三角瓶口上 （瓶內(nèi)事先注入厚1 cm滅菌PDA培養(yǎng)基），加中性硅膠塞封口，試驗(yàn)設(shè)置若干組，置26℃培養(yǎng)，取出瓶內(nèi)耳片后，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察瓶底部培養(yǎng)基孢子萌發(fā)情況。

將孢子萌發(fā)形成的單菌落挑至斜面培養(yǎng)基中編號培養(yǎng)，待菌絲滿管，于4℃條件下保藏。

1.3.2 單核菌絲篩選

無菌操作挑取上述培養(yǎng)菌絲體制成水封片，置于高倍顯微鏡下觀察，無鎖狀聯(lián)合且菌絲細(xì)弱者即為單核菌絲，確認(rèn)后標(biāo)記為雜交親本。

1.3.3 雜交組合設(shè)計

實(shí)驗(yàn)采用單核菌絲雜交育種進(jìn)行種內(nèi)雜交 （兩點(diǎn)法）。在同一平板培養(yǎng)基 （直徑90 mm）上相距1.5 cm，分別接種不同單孢子萌發(fā)的單核菌絲，26℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.4 雜交子鑒別

1）鏡檢鎖狀聯(lián)合

挑取雜交組合相交部位的菌絲，制成水封片，置于40×10倍顯微鏡下觀察鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。

2）拮抗實(shí)驗(yàn)

采用三點(diǎn)法在平板培養(yǎng)基中分別接入親本和雜交子，26℃培養(yǎng)觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3）酯酶同工酶電泳法鑒定雜交子

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[10－12]。

（1）樣品制備

菌絲體培養(yǎng)：采用1.1.3中的液體培養(yǎng)基，無菌條件下接種試管斜面菌絲體，靜置24 h后置于搖床中，溫度26℃， 220 r·min－1條件培養(yǎng)， 培養(yǎng)時間為 5 d。

收集菌絲球，40℃烘干。分別稱取0.5 g菌絲球、0.5 g石英砂，將樣品提取液1 mL放于研缽中冰浴研磨，4℃，10000 r·min－1離心10 min，取上清液，將上清液、蔗糖、溴酚藍(lán)按 （體積比）5∶1∶1混合制成樣品液 （研磨離心后的樣品須當(dāng)天使用）。

（2）凝膠制備

分離膠：將分離膠緩沖液、分離膠貯液、蒸餾水、過硫酸銨，按體積比1∶2∶2∶4比例混合均勻，用移液槍加入電泳槽中至距短板上沿3 cm處，并封上適量蒸餾水，使分離膠液面平行。待膠聚合后用吸水紙小心將水分吸盡。

濃縮膠：將濃縮膠緩沖液、濃縮膠貯液、核黃素溶液、蔗糖溶液按1∶2∶1∶4的體積比混合均勻，灌入膠室，立即插好樣品梳，日光燈下聚合。

（3）點(diǎn)樣

濃縮膠聚合后緩慢去除樣品梳，吸去點(diǎn)樣孔中多余水分，上槽、下槽加好電極緩沖液后，用50μL微量進(jìn)樣器吸取樣品20μL插入樣品槽底部，緩慢注入。

（4）電泳

將電泳槽和電泳儀相連，打開電源，平放于冰箱內(nèi)，連接電源，上槽為負(fù)極，下槽為正極。電泳在4℃冰箱中進(jìn)行。指示劑在濃縮膠位時，電壓180 V，待指示劑進(jìn)入分離膠后，電壓增至210 V，電泳采用穩(wěn)定檔。當(dāng)指示劑遷移至距膠板下緣2 cm左右時停止電泳。

（5）染色及固定

電泳完畢將凝膠立即轉(zhuǎn)移至染液中，直至出現(xiàn)褐色條帶，蒸餾水沖洗數(shù)次，置于固定液中固定。

（6） 結(jié)果計算

置于凝膠成像系統(tǒng) （76S/07969，Biorad）下拍照，計算遷移率 （Rf） 和相似系數(shù) （Se）。

實(shí)驗(yàn)以 “豐2”親本雙核菌絲與雜交子菌絲進(jìn)行酯酶同工酶譜分析對照，以鑒定雜交子真實(shí)性。

1.3.5 雜交子出耳試驗(yàn)

雜交子出耳試驗(yàn)在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行，以親本 “豐2”為對照，觀測雜交子結(jié)實(shí)能力及生產(chǎn)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子收集及單核菌絲篩選結(jié)果

鉤懸法結(jié)果顯示，26℃靜置3 d，可見瓶內(nèi)培養(yǎng)基上形成一個霧狀孢子印。無菌操作把懸掛瓶內(nèi)的耳片取出，26℃繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過3 d～4 d，孢子萌發(fā)，在培養(yǎng)基表面就會出現(xiàn)許多淺白色菌落 （圖1）。無菌挑取單孢子菌落（最好挑取瓶壁上的單個菌落）轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)。

挑取試管斜面菌絲制成水封片，置于顯微鏡下觀測，無鎖狀聯(lián)合且生長細(xì)弱的菌絲即為單核菌絲 （圖2），保存并作為雜交材料。

2.2 雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)共設(shè)置169對單核菌絲×單核菌絲隨機(jī)雜交組合。選取部分可親和雜交組 （目測）見表1。

圖1 單孢子萌發(fā)形成小菌落

圖2 顯微鏡下的單核菌絲（40×10 倍）

表1 單核菌絲雜交組合可親和組

2.3 雜交子鑒定結(jié)果

觀察各雜交試驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，部分菌落相交部出現(xiàn)了明顯的溝狀拮抗，鏡檢此區(qū)域菌絲未發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，則認(rèn)為試驗(yàn)組雜交不親合；而部分組合相交部位微微隆起形成明顯菌絲線 （圖3），鏡檢此區(qū)域菌絲發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，即認(rèn)為試驗(yàn)組雜交親合，對選定的雜交組合進(jìn)行鎖狀聯(lián)合鏡檢和親本拮抗實(shí)驗(yàn)初篩，最后經(jīng)酯酶同工酶電泳確定雜交子。

2.3.1 鏡檢鎖狀聯(lián)合

雜交成功則菌絲為雙核體，鏡檢可觀察到鎖狀聯(lián)合，見圖4。

圖3 單核4與16雜交菌落形態(tài)

圖4 雜交組合的鎖狀聯(lián)合（箭頭所指 40×10倍）

鏡檢表1各雜交組合菌絲，只有22×4、22×16、4×16雜交組合出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，且菌絲強(qiáng)壯，活力旺盛，初步認(rèn)為是雜交子 （雙核菌絲）。

2.3.2 拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

雜交株與親本株的拮抗試驗(yàn)是較為實(shí)用的鑒定方法。試驗(yàn)系統(tǒng)顯示，雜交菌株至少對親本株之一呈明顯的拮抗性，有些則對雙親株均呈現(xiàn)拮抗反應(yīng)，拮抗表現(xiàn)的多樣性反映著雜交子變異程度的不同[13]。雜交組合鏡檢及親本拮抗試驗(yàn)結(jié)果見表2。

將上述雜交子與親本 “豐2”進(jìn)行兩點(diǎn)培養(yǎng)，結(jié)果顯示雜交組合22×4、4×16與親本出現(xiàn)明顯拮抗線，其余組合與親本拮抗不明顯，初步確認(rèn)試驗(yàn)組22×4、4×16為雜交子。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行酯酶同工酶譜分析，進(jìn)一步驗(yàn)證雜交子真實(shí)性。

表2 雜交組合鏡檢及親本拮抗試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 酯酶同工酶譜分析結(jié)果

酯酶同工酶電泳酶帶的位置是由編碼各酶帶的基因直接決定的，所以通過觀察酶帶的條數(shù)、位置、寬度和染色深淺，可判斷雜交子與親本的基因組異同[14，15]。下面僅以雜交組合4×16為代表，說明本試驗(yàn)酯酶同工酶譜分析的方法與結(jié)果。

圖 5和圖 6分別為親本 （“豐 2”） 和雜交子 （4×16）酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜及其模式圖。

圖5 親本酯酶同工酶圖譜及模式圖

圖6 雜交子酯酶同工酶圖譜及模式圖

由圖5、圖6可以看出 “豐2”有6條酶帶，雜交組合4×16有7條酶帶，兩者共有的條帶數(shù)為5條。 “豐2”特有條帶1條，遷移率為0.885，雜交組合特有條帶2條，遷移率分別為0.318、0.602。由于酶帶的位置是由編碼各酶帶的基因直接決定的。所以可以知道這兩個菌株的基因組是不一樣的。同時從圖上也可以看出酶帶的寬度和顏色深淺不同，這表明酶的活性和含量也是不同的[14]。

計算親本與雜交子之間的相似系數(shù)Se，以 “豐2”作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，計算公式為：

式中：Se表示被檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品二者間相似系數(shù)；Sxy表示被檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品二者間共有酶帶數(shù)；Sx表示標(biāo)準(zhǔn)樣品特有酶帶數(shù)；Sy表示被檢樣品特有酶帶數(shù)。

相似系數(shù)表明了兩者之間的親緣關(guān)系，從結(jié)果可以看出來兩個菌株的遺傳特性是有明顯差別的。因此可以得出這樣的結(jié)論，雜交組合4×16是不同于親本 “豐2”的新菌株。

2.4 雜交子出耳試驗(yàn)結(jié)果

為考察雜交子生長、結(jié)實(shí)、產(chǎn)量等生產(chǎn)性狀，在相同條件下，以親本為對照進(jìn)行了雜交子料袋出耳試驗(yàn)。試驗(yàn)在人工氣候箱中完成。結(jié)果表明雜交子不僅具有結(jié)實(shí)能力，且生長優(yōu)勢較明顯。雜交子及親本生長活力比較試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 雜交子及親本生長活力比較試驗(yàn)結(jié)果

表3滿袋時間和菌絲生長速度充分顯示，雜交子4×16生長活力較親本旺盛；然而， “豐2”接種固體培養(yǎng)基后對栽培料適應(yīng)性較強(qiáng)，萌發(fā)最快，說明在生產(chǎn)應(yīng)用中可以通過培養(yǎng)基優(yōu)化，進(jìn)一步提升雜交子生產(chǎn)性能。雜交子4×16、22×4與 “豐2” 出耳試驗(yàn)結(jié)果見圖7、 圖8。

圖7 雜交子4×16與 “豐 2”出耳試驗(yàn)結(jié)果

圖8 雜交子22×4與 “豐 2”出耳試驗(yàn)結(jié)果

圖7、圖8說明，雜交子具有良好的結(jié)實(shí)性能，且在相同條件下，2組雜交子均表現(xiàn)出現(xiàn)蕾快、耳片生長快的優(yōu)勢特征；從子實(shí)體形態(tài)性狀考察，雜交子4×16的耳片舒展、厚實(shí)、圓整，較雜交子22×4更優(yōu)。

綜上結(jié)果，雜交子4×16實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)性狀優(yōu)勢顯著，具備白背毛木耳優(yōu)良新品種開發(fā)潛力。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)說明，利用單核菌絲進(jìn)行白背毛木耳種內(nèi)雜交育種方法可行。雜交子4×16表現(xiàn)出優(yōu)于親本的良好生產(chǎn)性狀，經(jīng)過生產(chǎn)適應(yīng)性馴化，極可能成為性狀優(yōu)良的白背毛木耳生產(chǎn)新品種。

進(jìn)行雜交子鑒定時，要將鏡檢鎖狀聯(lián)合、親本拮抗實(shí)驗(yàn)、酯酶同工酶電泳圖譜分析相結(jié)合，才具有較高的可信度。

拮抗試驗(yàn)結(jié)果只能作為判定雜交親和性的部分依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)挑取雜交子時發(fā)現(xiàn)，雖然單核菌落間有隆起的生長線 （常規(guī)判斷為拮抗線），但取此區(qū)域菌絲鏡檢卻分明看到鎖狀聯(lián)合，顯示雜交成功。這種情況雖然具有實(shí)際應(yīng)用價值，但尚需探討其理論機(jī)制。

在實(shí)際操作過程中，酯酶同工酶電泳技術(shù)仍存在溫度條件難控制，酶活性不穩(wěn)定等問題[16]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，白背毛木耳酯酶同工酶的種類和酶活性與菌絲球的液體培養(yǎng)時間有關(guān)，培養(yǎng)時間越長酶譜中酶帶顏色越深 （酶活性越強(qiáng)），因此，電泳條件的控制和一致性是極為重要的。

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