李彩鳳，趙麗影，陳業(yè)婷，越 鵬，谷 維，王園園，滕祥勇，王楠博

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

脂氧合酶（Lipoxygenase,編號(hào) EC1.13.11.12,LOX）俗稱脂肪氧化酶、脂肪加氧酶或脂肪氧合酶。分子質(zhì)量范圍一般在90 000～100 000之間，是一種含非血紅素鐵蛋白的氧合酶，酶蛋白由單肽鏈組成，屬氧化還原酶。它是通過專門催化具有順、順-1，4戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，生成脂肪酸氫過氧化物，而由脂氧合酶啟動(dòng)合成的一系列環(huán)狀或脂肪族化合物，統(tǒng)稱為氧脂，一般將此代謝過程稱之謂LOX途徑或十八碳酸途徑[1]。在植物界中，脂氧合酶底物主要是亞油酸（LA）、亞麻酸（LNA）等，其加氧位置是C9和C13（見圖1）[2]。

圖1 LOX亞油酸和亞麻酸等主要底物上的加氧碳位Fig.1 Position of oxygen insertion on of linoleic and linolenic acid

近些年來，有關(guān)該酶的研究倍受人們關(guān)注。許多研究表明，植物L(fēng)OXs主要位于原生質(zhì)體、液泡和細(xì)胞質(zhì)中[1]。LOX是植物體內(nèi)一類重要同工酶，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老以及抵御機(jī)械傷害和病蟲侵染等逆境過程起重要的調(diào)節(jié)作用[3]，同時(shí)植物L(fēng)OX是一個(gè)多基因家族，存在著同工酶，所以在同一物種中，在不同的作用條件下可誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)，因此本文將對(duì)脂氧合酶在高等植物中的酶學(xué)特性、生理學(xué)功能及分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)單概括。

1 脂氧合酶酶學(xué)特性

1.1 脂氧合酶活性部位

就目前的研究報(bào)道來看，LOX活性部位的結(jié)構(gòu)尚不是很清楚，其活性部位的基團(tuán)可能含有鐵、芳香族氨基酸殘基和蛋氨酸殘基等，但是目前普遍認(rèn)為催化中心與鐵離子有關(guān)，其活化態(tài)為高自旋的氧化型三價(jià)鐵，非活化態(tài)為高自旋的還原型二價(jià)鐵[4]。LOX活性中心結(jié)構(gòu)使它們對(duì)底物有特異性的要求，其抑制劑根據(jù)其來源可分為人工合成的以及天然提取物，其抑制機(jī)理包括與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性部位、鰲合作用、還原作用和競(jìng)爭(zhēng)脂質(zhì)自由基[5]。例如，大豆LOX-1模型中，以鐵離子為中心，并且含有不同數(shù)目的內(nèi)源配體和外源配體[6]。Ohta等分析了稻胚中的脂氧合酶同工酶LOX-3的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)它為單一胚，其氨基酸組成與大豆和豌豆的類似，純酶含0.73 Fe atom·mol-1[7]。

1.2 脂氧合酶催化特性

在催化反應(yīng)機(jī)理上，Tappel等認(rèn)為，LOX所催化氧化的亞油酸不同于亞油酸自動(dòng)氧化過程[8]。首先是亞油酸、氧和LOX形成復(fù)合體；再在酶的表面形成一個(gè)雙游離基活化體，即一個(gè)氫離子和一個(gè)電子從亞油酸上轉(zhuǎn)移至氧分子上；雙游離基在酶分子表面結(jié)合形成亞油酸過氧化氫；此過氧化氫物與酶分離并脫落下來。而自由基理論認(rèn)為：首先氫原子從底物上離開，同時(shí)鐵離子被還原；分子氧與底物自由基反應(yīng),形成過氧化自由基，在此過程中有可能伴隨O2轉(zhuǎn)變成O2-·自由基，最后過氧自由基被LOX的鐵還原，生成氫過氧化合物，而LOX的鐵轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+，重新轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詰B(tài)[9]。近年來，大豆LOX中質(zhì)子電子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)證實(shí)了LOX反應(yīng)過程中的氫轉(zhuǎn)移理論[10]，認(rèn)為催化的氫原子從底物亞油酸轉(zhuǎn)移到鐵離子上；質(zhì)子和電子同時(shí)在供體和受體之間轉(zhuǎn)移；從而產(chǎn)生有效的氫隧道效應(yīng)。因此，從以上幾種理論都可以看出LOX催化中心與鐵離子有著密切的關(guān)系。

在應(yīng)用上，中國(guó)對(duì)LOX的研究主要集中在活性、pH、溫度或金屬離子絡(luò)合劑等影響酶活的因子及產(chǎn)生醛風(fēng)味物質(zhì)等方面，很少見有關(guān)催化機(jī)理、固定化及深層利用方面的報(bào)道[11]。國(guó)外在LOX固定化方面做過一些工作[12]，通過SP-HPLC對(duì)幾種水產(chǎn)動(dòng)植物中LOX催化亞油酸甲酯氧化形成的氫過氧化物進(jìn)行了定性、定量分析，這也是較突出的一面[13]。

1.3 脂氧合酶同工酶、最適溫度及pH

LOX報(bào)道始見于1932年，最初研究發(fā)現(xiàn)于大豆植物中[14]，因此也就注定了大豆LOX研究是最清楚的，現(xiàn)知道大豆種子中的LOX具有三種同工酶類型，即LOX-1、LOX-2、LOX-3，在受傷后不久的大豆葉片中也已分離出LOX-7、LOX-8兩種同工酶，并發(fā)現(xiàn)這兩種同功酶在幼葉、花和未成熟的莢中都存在，并具有很高的酶活性[15]。目前大豆的LOX-1、LOX-3、兔網(wǎng)織紅血球LOX-1晶體結(jié)構(gòu)，這三種生物的LOX已經(jīng)被研究清楚[16]。

如今已從水稻成熟種胚中也分離出了三種LOX同工酶，根據(jù)層析圖譜洗脫順序的不同，分別定名為水稻LOX-1、LOX-2和LOX-3，其中LOX-1和LOX-2屬于第Ⅱ類LOX，即13-LOX，而LOX-3屬于第Ⅲ類LOX即9-LOX[17]。在水稻不同品種的種子成熟過程中，LOX活性變化規(guī)律不一致。在水稻成熟過程中，種子中LOX-3活性和表達(dá)水平都顯著高于其他兩種同工酶，種子萌發(fā)過程中LOX-2活性和表達(dá)水平占優(yōu)勢(shì)，而LOX-1在種子成熟和萌發(fā)過程中無論在活性和表達(dá)水平上都顯示比較低[18]。常見植物L(fēng)OX性質(zhì)如表1所示[19-24]。

表1 幾種植物L(fēng)OX的某些性質(zhì)Table 1 Characteristics of lipoxygenases of several plant

續(xù) 表

2 脂氧合酶生理學(xué)功能

2.1 脂氧合酶與衰老

植物衰老是一種受遺傳和內(nèi)外因子影響，且高度有序細(xì)胞程序化死亡的過程。對(duì)LOX生理功能的研究表明，在植物的衰老、抗病反應(yīng)以及其生長(zhǎng)過程中LOX都有一定的作用。由于LOX的反應(yīng)產(chǎn)物可進(jìn)一步生成自由基，以及細(xì)胞膜脂中的多聚不飽和脂肪酸鏈可受LOX催化而導(dǎo)致膜降解，因此，人們自然把LOX與衰老功能相聯(lián)系。植物L(fēng)OX的生理功能是為植物激素提供合成前體物，如茉莉酸（JA）及其甲酯和愈創(chuàng)激素[25]，其代謝產(chǎn)物中含有活性氧和氧自由基，對(duì)細(xì)胞膜具有一定的破壞作用，因而參與植物的衰老和抗病性過敏壞死反應(yīng)[26-27]。例如，愈創(chuàng)激素和愈創(chuàng)酸在植物組織傷口愈合時(shí)發(fā)生作用，防御受傷組織中病原菌的入侵。而茉莉酮酸類似于脫落酸（ABA），具有抑制生長(zhǎng)的作用，因而被認(rèn)為是植物衰老的促進(jìn)劑。在植物組織膜脂過氧化作用啟動(dòng)時(shí)，需要脂氧合酶，一旦脂質(zhì)過氧化反應(yīng)啟動(dòng)后，LOX便會(huì)自我活化，而衰老過程中膜磷脂的逐步降解，則是LOX底物游離脂肪酸的主要來源，LOX過氧化產(chǎn)物可導(dǎo)致組織衰老，其主要機(jī)制包括促進(jìn)合成蛋白質(zhì)酶類的失活、抑制葉綠體的光化學(xué)活性以及加速細(xì)胞膜的降解。因此，LOX對(duì)植物的衰老起著非常重要的作用，但是，只有當(dāng)生物體發(fā)育到一定階段或受到環(huán)境脅迫時(shí)LOX才啟動(dòng)[28]。例如，綠豆子葉衰老過程中線粒體膜對(duì)幾種氨基酸的透性隨衰老進(jìn)程而下降，表現(xiàn)為離體線粒體膜在脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸等滲溶液中的膨脹率從2天齡到5天齡子葉逐漸下降[29]，但是，在整個(gè)植物的衰老過程中這幾種氨基酸并不都呈下降趨勢(shì)，其原因有待進(jìn)一步研究。研究表明，隨著果實(shí)的成熟和衰老，LOX活性逐漸升高[23]。例如，在蘋果果實(shí)發(fā)育及后熟過程中，其幼果期的LOX均出現(xiàn)較高活性高峰，之后下降，至成熟后果實(shí)LOX活性又開始提高[30]?？梢?，LOX活性表達(dá)狀況可能是衡量果實(shí)貯藏特性的一個(gè)重要因素。

2.2 脂氧合酶與外界條件

在植物生長(zhǎng)期間，溫度、水分、光照、鹽濃度、抑制劑等都會(huì)影響LOX活性變化，在果實(shí)成熟及貯藏期間表現(xiàn)得尤為明顯。研究表明，貯藏溫度、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等變化，都會(huì)影響果實(shí)組織LOX活性變化，但對(duì)于非躍變型果實(shí)成熟與衰老過程中LOX活性變化情況報(bào)道較少[31]。常溫下植物果實(shí)軟化衰老加快，LOX活性較高，在貯藏前期，低溫可顯著抑制LOX的活性且在一定程度上延遲了衰老[32]。外施水楊酸處理豌豆葉片可降低其茉莉酸含量，有效抑制LOX活性從而延緩了植物的衰老[33]。

2.3 植物脂氧合酶活性測(cè)定

目前脂氧合酶測(cè)定的方法有很多種，但是每一種測(cè)定方法都有其不同的測(cè)定原理、參數(shù)及優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果見表2[34-38]。

表2 幾種測(cè)定脂氧合酶催化活性方法的比較Table 2 Comparison of determination methods of lipoxygenase catalytic activity

在LOX活性測(cè)定的方法上，根據(jù)不同試驗(yàn)?zāi)康牡男枨笤诓粩嗟母倪M(jìn)。如今又已開發(fā)研制了植物脂氧合酶同功酶快速檢測(cè)技術(shù)，是利用脂氧合酶偶聯(lián)氧化還原指示劑產(chǎn)生顯色反應(yīng)的原理，建立測(cè)定LOX同功酶活性的方法。例如，通過此技術(shù)對(duì)大豆種質(zhì)資源和后代材料進(jìn)行篩選，得到大豆脂氧合酶同功酶部分缺失和全缺失材料，以及應(yīng)用于無豆腥味大豆品種進(jìn)行輔助育種具有極其重要的意義[39]。通過染色和顯色法快速測(cè)定番茄中LOX酶活變化，研究其與果實(shí)成熟度和揮發(fā)性香氣成分間的關(guān)系等[40]。

3 脂氧合酶的分子生物學(xué)

3.1 脂氧合酶基因克隆

如今研究者已經(jīng)利用分子克隆技術(shù)首次在1987年確定了大豆LOX-1的完整氨基酸序列，并且在研究脂氧合酶誘導(dǎo)防御對(duì)于大豆品種的襲擊中表明，消除了LOX同工酶和Kunitz型蛋白酶抑制劑的大豆種子，克服了不良豆腥味大豆產(chǎn)品產(chǎn)生的相關(guān)問題[41]。人們已經(jīng)從擬南芥、番茄、馬鈴薯、煙草、獼猴桃等植物中分別克隆到了多個(gè)基因家族成員。根據(jù)GenBank公布的氨基酸序列，構(gòu)建了1個(gè)植物L(fēng)OX基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，得知該系統(tǒng)樹由3個(gè)分支組成[42]。而利用獼猴桃EST庫(kù)及相關(guān)生物信息學(xué)手段，從果肉組織克隆了LOX基因家族成員6個(gè)，命名為 AdLOX1～6。AdLOX1、AdLOX2、AdLOX3和AdLOX4為全長(zhǎng)cDNA，AdLOX5和AdLOX6為cDNA片段[43]。到目前為止，至少有40多種植物L(fēng)OX的基因被分離鑒定，這為研究它們之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，闡明基因序列、結(jié)構(gòu)、位置特異性和活性之間的關(guān)系提供了可能。

3.2 脂氧合酶基因表達(dá)

脂氧合酶基因家族在植物界廣泛存，是一個(gè)多基因的家族，具有9-LOX和13-LOX兩種類型，存在著不同數(shù)量的同工酶，同一物種的不同發(fā)育階段、以及不同的脅迫作用，可誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)。研究表明，植物L(fēng)OX基因的表達(dá)貫穿于植物生活史的整個(gè)過程，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，包括種子的萌發(fā)、塊莖的形成、結(jié)節(jié)的發(fā)育、果實(shí)的成熟以及植物體的衰老，都存在著相應(yīng)LOX基因表達(dá)[44]。例如，煙草Phytopathora parasitica可以誘導(dǎo)LOX在煙草葉片表達(dá)并產(chǎn)生過敏性細(xì)胞死亡[45]； Hildebran等觀察到大豆葉片受傷后，LOX活性和基因表達(dá)都因葉片受傷而增加[46]；受發(fā)育信號(hào)調(diào)節(jié)，一些特異的LOX基因在大麥、黃瓜和大豆種子萌發(fā)的早期階段被誘導(dǎo)[47]。果蔬類已從番茄中克隆到4種不同的LOX基因，即從果實(shí)中得到的tomLOXA和tomLOXB，以及從葉片中得到的tomLOXC和tomLOXD[3]，并且在不同的組織或同一組織的不同發(fā)育階段有不同的表達(dá)模式。不同植物的LOX基因表達(dá)已經(jīng)逐漸被研究清楚，說明研究LOX基因技術(shù)也在不斷的發(fā)展成熟中。

3.3 脂氧合酶基因與逆境

研究表明，水稻LOX-3是主要的種胚脂氧合酶同工酶，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，反義LOX-3轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水分脅迫、稻瘟病和白葉枯病都表現(xiàn)敏感，說明水稻種胚LOX-3基因在逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用[48]。許多植物的LOX基因在傷害和病原物誘導(dǎo)下表達(dá)。例如，水稻稻瘟病菌可以誘導(dǎo)LOX的表達(dá)[49]。此外，國(guó)外的研究者在誘導(dǎo)9-LOX耐鹽的鹽細(xì)胞臍橙上，為了試圖解決LOX活性的過氧化物的積累作用，分析了細(xì)胞中的臍橙，在蛋白的表達(dá)條件和壓力下對(duì)不同鹽敏感性進(jìn)行分析，均在體外和體內(nèi)揭示了9-LOX活性和一個(gè)非?？焖贉p少氫過氧化物的相應(yīng)羥基衍生物。這表明代謝產(chǎn)物之一在進(jìn)一步下游還原酶通路可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)鹽脅迫等逆境起著防御作用[50]。

總之，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使植物L(fēng)OX生理功能的研究得以加快，這必將有助于深入探討植物L(fēng)OX基因與逆境調(diào)控的關(guān)系，可為研究植物L(fēng)OX的作用機(jī)制提供新途徑。

4 脂氧合酶研究展望

對(duì)脂氧合酶的研究大約已有70多年的歷史，無論是在LOX生化特性還是在基因的克隆及表達(dá)上都有很大的進(jìn)步。很多的研究者也開始研究LOX對(duì)外界不良的環(huán)境及生理?xiàng)l件的影響，其目的是為了研究出能夠產(chǎn)生抗性的植株。同時(shí)研究者也開始利用基因沉默、基因刪除等手段進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的研究，同時(shí)對(duì)LOX產(chǎn)物分析的方法也在不斷地改進(jìn)，從而大大地推動(dòng)了LOX途徑及代謝產(chǎn)物生理作用的研究。LOX在工業(yè)上應(yīng)用前景也將非常廣闊，可用于染料、涂料、洗滌劑或聚氯乙烯增塑劑等的工業(yè)化生產(chǎn)。

我國(guó)對(duì)脂氧合酶的研究起步較晚，針對(duì)其動(dòng)力學(xué)、分子生物學(xué)以及抑制機(jī)理的研究是今后應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)的。許多試驗(yàn)表明，LOX具有氧化生物膜的能力，其作用機(jī)制有待深入探討。由于脂氧合酶對(duì)油脂的氧化作用，導(dǎo)致一些食品品質(zhì)下降，貨價(jià)期相對(duì)縮短，因此，對(duì)脂氧合酶的抑制機(jī)理及抑制方法的研究也具有重要的意義。

此外，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段，從分子水平深入揭示LOX對(duì)植物不同器官、組織及細(xì)胞衰老的作用機(jī)制，進(jìn)而采用多種方法調(diào)控由多條代謝途徑組成的植物衰老系統(tǒng)，設(shè)計(jì)出更好的調(diào)控衰老戰(zhàn)略方法，并使其應(yīng)用到經(jīng)濟(jì)作物上，這樣才能實(shí)現(xiàn)最大的理論和現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

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