熊大芾，郭 瑋，劉鐵堅，陳 松，鄒學農(nóng)，彭新生

隨著人口的老齡化以及居民生活水平的提高，近年來我國前列腺癌的發(fā)病率有顯著增長的趨勢。前列腺癌是最易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，約70%的前列腺癌患者死于骨轉(zhuǎn)移。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的確切機制目前尚不十分清楚，臨床上亦缺乏有效的治療手段[1-3]。部分微小RNA（microRNAs，miR）具有腫瘤抑制基因功能，其在結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、淋巴癌等中表達明顯下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關系[4-10]。我們研究發(fā)現(xiàn)，相較于原發(fā)腫瘤組織，前列腺骨轉(zhuǎn)移組織中的miR-145表達水平明顯下調(diào)，提示其可能參與了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的病理生理過程。Sachdeva等[11]的研究表明，miR-145通過抑制c-Myc的表達起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。而建立高表達miR-145的PC-3骨轉(zhuǎn)移細胞系對研究其在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移機制中的作用至關重要?，F(xiàn)將PC-3/pMSCV-vector及PC-3/pMSCV-miR-145穩(wěn)定細胞株建立的方法與結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系

前列腺癌細胞系PC-3購自ATCC；感受態(tài)細胞DH5α、載體質(zhì)粒pMSCV-puro、人胚胎腎細胞293FT為本實驗室保存。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRⅠ購自New England Biolabs公司，TIANamp Genomic DNA Kit購自天根生物科技公司，膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司，F(xiàn)-12培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自Hyclone公司，polybrane購自Sigma-Aldrich公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine2000和RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，熒光實時定量PCR試劑盒購自復能基因公司。

1.2 pMSCV-miR-145質(zhì)粒的構建

1.2.1 載體序列分析 pMSCV-puro上有BglⅡ、EcoRⅠ兩個限制性內(nèi)切酶的酶切位點，可以利用此兩內(nèi)切酶將目的基因片段克隆至pMSCV-puro表達載體。載體結(jié)構圖譜見圖1。

1.2.2 基因序列分析 已知miR-145的cDNA序列為 AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC（http://genome.ucsc.edu），為方便擴增，查找出其上下游各約500 bp的序列一并進行PCR擴增。根據(jù)基因信息設計以下擴增引物：

Forward：

gccAGATCTACCGAGGAGCAGGAGGAGAA Reverse：gccGAATTCGCGTTGGGAAGTGGGTTGAG

圖1 pMSCV-puro載體結(jié)構圖譜

1.2.3 載體的構建 按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒說明書提取正常乳腺細胞的基因組DNA（細胞由中山大學附屬第一醫(yī)院外科實驗室惠贈）。將提取的基因組DNA用nuclease-free水溶解，濃度為1 μg/μl，以其為模板，用上述引物進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物和pMSCV-puro質(zhì)粒用BglⅡ和EcoRⅠ進行酶切，使其5’和3’端產(chǎn)生帶有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點的粘性末端。在T4 DNA連接酶作用下，使兩者在16℃下反應過夜，形成重組質(zhì)粒；取重組質(zhì)粒3 μl轉(zhuǎn)化200 μl感受態(tài)細胞DH5α，將轉(zhuǎn)化過的細胞涂于含氨芐青霉素的平板上，37℃過夜。從平板上挑取2個單克隆菌落分別命名為test1和test2接種于LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化重組質(zhì)粒。

1.2.4 重組質(zhì)粒的鑒定 各取重組質(zhì)粒3 μg，用BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切擴增后行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定合格的質(zhì)粒命名為pMSCV-miR-145，并取相應菌液送至英駿生物技術公司進行測序，鑒定插入的堿基序列順序是否正確。

1.3 制備逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV-vector和pMSCV-miR-145

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒制備 培養(yǎng)293FT細胞，種板24～48 h，待細胞貼壁率達60%時按照lipofectamine2000（invitrogen）說明書將制備好的載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。4 h后換液，細胞培養(yǎng)箱過夜。載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒在293FT細胞中結(jié)合，產(chǎn)生大量病毒并釋放入培養(yǎng)基中。隔天用10 ml注射器收集含病毒的培養(yǎng)基，同時換取新鮮培養(yǎng)基到293FT的培養(yǎng)皿中；0.45 μm過濾器過濾病毒液。之后每隔3小時收集一次病毒。

1.3.2 感染細胞株 按5×105密度將PC-3細胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中（F-12+10%FBS），24 h后開始感染病毒。病毒液中以1000：1的比例加入polybrane并混勻。棄去待感染細胞的培養(yǎng)基，吸取2 ml病毒液至PC-3細胞中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后換2 ml新病毒液繼續(xù)感染細胞，3 h后更換正常培養(yǎng)基過夜。隔天以2 ml新病毒液再次感染細胞，3 h后換回正常培養(yǎng)基。感染結(jié)束后24～48 h，加入含puromycin（0.5 μg/ml）的細胞培養(yǎng)基篩選陽性細胞，連續(xù)篩選3 d，更換正常培養(yǎng)基。

1.4 穩(wěn)定細胞株PC-3/pMSCV-vector、PC-3/pMSCV-miR-145的鑒定

1.4.1 用Trizol裂解各細胞株，提取RNA進行熒光實時定量RT-PCR，以檢測miR-145在PC-3/pMSCV-miR-145細胞中的表達水平。以PC-3/pMSCV-vector細胞株為空載體對照，以PC-3細胞株為空白對照，以鑒定穩(wěn)定表達miR-145的細胞株是否已成功建立。

1.4.2 根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄 通過Poly A Polymerase對所有miRNA的3’端進行加“PolyA”尾處理，延長各成熟miRNA的長度以用于后續(xù)反應；同時利用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RTase及與“Poly A”特異性結(jié)合的Oligo dT Adaptor引物對Poly A化的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。

1.4.3 根據(jù)說明書進行熒光實時定量PCR擴增 用特異性正向引物、通用反向引物和試劑盒中含SYBR Green、dNTP、DNA聚合酶及相關buffer的混合液對cDNA進行特異性PCR擴增和檢測。待檢基因miR-145的正向引物序列：GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCTA。內(nèi)參基因homosnU6的正向引物序列：CAAATTCGTGAAGCGTTCCATAT。

1.4.4 運用The Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System進行qRT-PCR檢測。然后得出各孔CT值并算出均值，采用2-ΔΔCT法進行相對定量。ΔΔCT=（CT試驗組miR-145— CT對照組miR-145）—（CT試驗組U6—CT對照組U6），此處的對照組為pMSCV-vector空載體對照組。miR-145的相對表達量RQ=2-ΔΔCT。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學處理，組間整體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

由圖1可知，若目的基因插入正確，即可被BglⅡ和EcoRⅠ酶切出一條約1173 bp的DNA條帶。本實驗構建的載體經(jīng)酶切鑒定，切出一條約1173 bp的條帶（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳結(jié)果

2.2 基因測序

測序結(jié)果如圖3，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)插入DNA片段無突變。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和藥物篩選結(jié)果

轉(zhuǎn)染24 h后重組質(zhì)粒開始表達，此時通過puromycin篩選可殺死未轉(zhuǎn)染成功的細胞。3 d后，當空白對照組細胞全部死亡時，轉(zhuǎn)染組存活的細胞即為轉(zhuǎn)染成功的細胞，各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率約為80%～90%。熒光實時定量RT-PCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pMSCV-miR-145實驗組細胞的miR-145表達水平與pMSCV-vector空載體對照組之間相比差異達2000倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。證明在穩(wěn)定篩選出的細胞株中，miR-145的表達水平升高，穩(wěn)定株篩選成功（圖4）。

表1 各細胞株中miR-145的表達差異

圖3 pMSCV-miR-145的測序圖

圖4 qRT-PCR鑒定miR-145在各細胞株中的mRNA表達水平

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤治療的瓶頸。骨轉(zhuǎn)移是前列腺癌晚期的主要表現(xiàn)，無論采用何種治療方法，患者的生存期僅能維持2～3年。明確前列腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機制可以為疾病的預防和靶向性治療提供新的思路和依據(jù)，因此眾多學者致力于這方面的研究。近期報道顯示，上調(diào)或抑制miRNA的表達可能是延緩腫瘤病灶轉(zhuǎn)移的有效手段，但目前針對miRNA與腫瘤骨轉(zhuǎn)移的相關研究報道甚少，其在骨轉(zhuǎn)移過程中的變化及其作用尚未明確[12-14]。

miRNA是一類新的高度保守的、非編碼的小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)不完全性互補配對，對基因表達起負調(diào)節(jié)作用或產(chǎn)生基因沉默。雖然在表達基因中僅占很小一部分，但作為一種新的廣泛存在的基因表達調(diào)節(jié)分子，miRNA可以通過調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、生存、運動和形態(tài)發(fā)生等在生物體的生長、發(fā)育、衰老及死亡的調(diào)控過程中扮演重要角色[4]，是機體發(fā)育和細胞穩(wěn)態(tài)維持的關鍵調(diào)節(jié)因子。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用[4-15]。在前列腺癌轉(zhuǎn)移灶細胞系LNCaP中，miR-145的異常表達可引起細胞的增殖抑制；對LNCaP細胞系進行miR-145轉(zhuǎn)染后，最大可達到100%的生長抑制[10]。LNCaP來源于前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，miR-145可以影響前列腺癌轉(zhuǎn)移細胞的生長，這一結(jié)果進一步證實miR-145的表達水平與前列腺癌細胞的生物學行為密切相關，但與其轉(zhuǎn)移是否存在直接聯(lián)系，目前尚無定論；在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞系PC-3和腦轉(zhuǎn)移細胞系DU145中，miR-145通過抑制BNIP3的表達，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，但是否跟腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有關也尚未得到證實[16]。故miRNA、靶蛋白和腫瘤轉(zhuǎn)移三者之間的關系還有待進一步探討。因此，從研究miRNA入手，闡明miRNA與骨轉(zhuǎn)移的關系及其參與轉(zhuǎn)移的作用機制，可為進一步探索從根本上預防和治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的方法提供理論依據(jù)。而要達到這一目標，首先需要解決的問題是獲得穩(wěn)定高表達miR-145的腫瘤細胞株。

目前在細胞中過表達miRNA的常用方法有3種：（1）化學合成制備目的miRNA，通過轉(zhuǎn)染介質(zhì)如陽離子脂質(zhì)體將目的miRNA轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)；（2）miRNA表達質(zhì)粒載體；（3）病毒載體[11]。前一種為瞬時表達，后兩種為穩(wěn)定表達。化學合成miRNA加脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法適用范圍較廣，目的序列明確，無需考慮克隆載體的突變和加工的效率問題，量可控制，可以研究濃度依靠性效應；此外，化學合成的這種小RNA分子轉(zhuǎn)染方便，不會對細胞造成毒性效應。但因其僅為瞬時表達，故只能用以研究一段時間內(nèi)的靶基因表達水平，不能獲得穩(wěn)定遺傳的細胞系來進行長時間的研究，重復性較差。體內(nèi)表達制備miRNA的優(yōu)點在于可以進行較長時期的研究，特別是在帶有抗性基因的載體轉(zhuǎn)染成功后可以采用相應的抗生素進行篩選，從而使miRNA在細胞中能夠持續(xù)抑制靶基因的表達。病毒載體用于miRNA表達的優(yōu)勢在于可以高效率地直接感染細胞，部分病毒載體還可將自身基因和目的基因整合在宿主細胞的基因組中，使之隨宿主細胞基因的表達而大量表達[17]。以往研究中多采用重組腺病毒，但因其屬于DNA病毒，所攜帶的目的基因仍難以整合到宿主細胞的DNA中（僅為0.001%～1%），且無法傳到子代并獲得穩(wěn)定的表達[18]。作為一種RNA病毒，本實驗采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有與腺病毒同樣高效的感染細胞功能，且目的基因可隨病毒RNA一起整合到宿主的DNA中，隨細胞分裂傳至子代細胞而獲得穩(wěn)定的表達[19]。miRNA運用病毒載體轉(zhuǎn)染可以進行基因沉默的較長時間研究，可避免因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便，且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定，尤其適用于已知一個有效的miRNA序列且需要維持較長時間的基因沉默研究[20]。但需注意的是病毒具有一定的毒性，且病毒載體制備周期較長，費用較高?？傊?，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的RNA干擾，可以長期穩(wěn)定地對靶基因進行沉默，能夠解決化學合成序列-脂質(zhì)體復合物法或質(zhì)粒載體法瞬時、低效的缺點，拓展了RNA干擾的使用范圍，是目前國內(nèi)外研究基因功能較為先進的技術，適用于長時間的基因功能研究[21]。

總之，我們成功建立了穩(wěn)定高表達miR-145的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞系，為明確miR-145在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移機制中的作用奠定了基礎，為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的預防和靶向性治療研究提供了實驗依據(jù)。

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