趙學(xué)峰，羅麗貞，區(qū)云枝

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東佛山 528200）

乳酸菌（lactic-acid bacteria）廣泛存在于人、畜、禽的腸道，能夠調(diào)節(jié)機體胃腸道正常菌群生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價，降低血清膽固醇，控制機體內(nèi)毒素、腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，制造營養(yǎng)物質(zhì)，刺激組織發(fā)育，從而對機體的營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、細(xì)胞感染、藥物效應(yīng)、毒性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、衰老過程和應(yīng)急反應(yīng)等產(chǎn)生作用。目前，已有眾多文獻報道利用乳酸菌作為載體表達外源基因，進行疾病的防治；但傳統(tǒng)的乳酸菌表達載體為保持一定的選擇壓力，大多帶有1個或多個編碼特定抗生素抗性的基因（如紅霉素抗性基因等），存在潛在的抗生素耐藥性播散的危險。

細(xì)菌的營養(yǎng)缺陷型是指細(xì)菌的某些基因如管家基因編碼的產(chǎn)物催化細(xì)菌的基本代謝反應(yīng)，這些基因突變或缺失后，不能合成相應(yīng)產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)菌在外界環(huán)境中或基本培養(yǎng)基上不能生長，需要補充相應(yīng)的底物。胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，ThyA）基因編碼胸苷酸合成酶，在DNA合成中起關(guān)鍵作用，缺失ThyA基因的菌株在基本培養(yǎng)基上不能生長；染色體整合是一種有效的改造微生物的手段，插入序列、轉(zhuǎn)座子和同源重組是染色體整合的通常形式，其中同源重組的特點是能夠按人們所預(yù)期的基因位置進行染色體整合[1-2]。

因此，本研究擬利用細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型互補和同源重組的原理，構(gòu)建一個可應(yīng)用于乳酸菌的同源重組載體。利用該同源重組載體可將目的基因整合于消化道共生乳酸菌染色體中，實現(xiàn)外源基因在乳酸菌中的整合型表達，為構(gòu)建能高效、安全分泌表達外源目的基因的轉(zhuǎn)基因乳酸菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和生長條件

大腸埃希菌 DH5α、乳酸乳球菌 MG1363（Lactococcus lactis MG1363）、質(zhì)粒 pMUTIN4[3]由本室保存。DH5α 常規(guī)培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)；乳酸菌常規(guī)培養(yǎng)在GM17培養(yǎng)基（M17培養(yǎng)基，0.5%葡萄糖），30℃靜止培養(yǎng)。氨芐青霉素在E.coli培養(yǎng)中的濃度為 100 μg/ml。

1.1.2 主要試劑和材料

高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DL2000 Marker、限制性內(nèi)切酶均購自大連Takara公司；M17購自O(shè)xoid公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒購自Sigma公司；引物委托上海英俊公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 L.lactisMG1363基因組DNA的制備及質(zhì)粒小量提取

參考革蘭陽性菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。主要操作如下：收集適量處于對數(shù)生長期的乳酸菌細(xì)菌沉淀，加入適量溶菌酶，充分酶解后加入適量無水乙醇混勻，將其全部轉(zhuǎn)移至柱中。充分洗滌后用洗脫液將吸附在柱子膜上的DNA洗脫，采用紫外分光光度法測定基因組DNA濃度，-80℃保存，備用。

參考質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA（堿裂解法）。采用紫外分光光度法測定質(zhì)粒DNA濃度，-80℃保存，備用。

1.2.2 引物設(shè)計及目的基因的PCR擴增

1.2.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)已發(fā)表的乳酸菌L.lactis MG1363全基因組中ThyA基因序列[4]，用軟件Primer 5.0設(shè)計引物并引入相應(yīng)的酶切位點，用作重組質(zhì)粒的多克隆位點（表1）。引物委托上海英俊公司合成。

1.2.2.2 ThyA基因ATG上游片段（ThyA-up）的PCR擴增與鑒定 PCR擴增乳酸菌基因組中ThyA基因起始密碼上游1050 bp片斷。PCR反應(yīng)體系如下：5×PCR PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μl，dNTP Mixture 4 μl，模板 2 μl，引物各1 μl，PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μl， 補水至 50 μl。反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性 30 s；98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收純化目的片段，-80℃保存，備用。

表1 引物序列及其引入的酶切位點Tab.1 The sequences of primers and the introduced restriction enzyme sites

1.2.2.3 ThyA基因終止密碼下游片段（ThyA-down）的PCR擴增與鑒定 PCR擴增乳酸菌基因組中ThyA基因起始密碼下游1010 bp片斷，以ThyA-down-F和ThyA-down-R為引物，PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件同“1.2.2.2”。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收純化目的片段，-80℃保存，備用。

1.2.2.4 同源重組載體的構(gòu)建策略與鑒定 ①純化后的ThyA-up基因片段與質(zhì)粒pMUTIN4經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)。次日挑取單菌落增菌，提取質(zhì)粒進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pThyA-up（圖1）。②重組載體pThyA-up和制備好的PCR片斷ThyA-down經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)。次日挑取單菌落增菌，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pThyA-up-down（圖1）。

2 結(jié)果

2.1 ThyA-up基因的PCR擴增與鑒定

以乳酸乳球菌基因組為模板，進行PCR擴增，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物片段約1050 bp，符合預(yù)期片段長度（圖 2）。

2.2 重組載體pThyA-up的酶切鑒定

將PCR產(chǎn)物ThyA-up基因經(jīng)膠回收純化后克隆到質(zhì)粒pMUTIN4多克隆位點上，對重組載體進行雙酶切鑒定（圖3）。結(jié)果顯示，目的片段ThyA-up已成功連接至質(zhì)粒pMUTIN4多克隆位點上，表明pThyA-up構(gòu)建成功。

2.3 ThyA-down基因的PCR擴增與鑒定

以乳酸乳球菌基因組為模板，進行PCR擴增，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物片段約1010 bp，符合預(yù)期片段長度（圖 4）。

2.4 將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到重組質(zhì)粒pThyA-up，對重組載體進行雙酶切鑒定（圖5）

結(jié)果顯示，ThyA-down基因已成功連接至重組質(zhì)粒pThyA-up（pThyA-up-down）。將乳酸菌同源重組載體pThyA-up-down進一步測序確證，測序結(jié)果顯示與理療序列完全一致（測序圖略），表明乳酸菌同源重組載體pThyA-up-down構(gòu)建成功。

3 討論

乳酸菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，表達的外源蛋白無需經(jīng)過純化可以直接連同菌體一起服用，被公認(rèn)為是安全級（generally regarded as safe，GRAS）微生物；其外源基因容量大，刺激細(xì)胞免疫能力強，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，亦是理想的基因治療載體；但無論何種類型的載體都必須帶有1個或多個有效的篩選標(biāo)記以確保重組子的篩選；但如果這種帶有抗性基因的菌株投放到環(huán)境中或人體、動物體內(nèi)，由于抗性基因有轉(zhuǎn)移的可能，將為相應(yīng)抗生素的使用帶來嚴(yán)重后果，因此其實際應(yīng)用必然要受到限制[5]。

由此可見，更安全有效的方法就是將目的基因整合至乳酸菌染色體中，讓其在乳酸菌中持續(xù)表達，同時又避免了抗性基因的引入（但可通過細(xì)菌營養(yǎng)互補篩選重組菌株）。因此，本研究利用細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型互補和同源重組的原理，構(gòu)建了可應(yīng)用于乳酸菌的同源重組載體pThyA-up-down，其全長9900 bp，包括一個來自大腸埃希菌的復(fù)制子ColE1，一個報告基因LacZ以及2個篩選標(biāo)記（selective marker）：來自乳酸菌的ThyA基因和能在乳酸菌中進行抗性篩選的紅霉素基因（當(dāng)整合完成的同時，紅霉素抗性基因隨之丟失）。此外，目的基因與染色體發(fā)生重組是一個隨機過程，重組效率很低，后期陽性克隆的獲得需要大量的篩選工作；而報告基因LacZ的引入，可在培養(yǎng)基上直接挑取藍色菌落進行鑒定，從而提高篩選效率，并大大簡化陽性克隆篩選的過程。

同源重組的特點是能夠按人們所預(yù)期的基因位置甚至堿基序列位置進行染色體整合。ThyA是一種廣泛存在于原核、真核細(xì)胞中的管家基因。ThyA基因編碼胸苷酸合成酶，在體內(nèi)DNA合成中起關(guān)鍵作用，ThyA基因缺失導(dǎo)致dTMP從頭合成途徑受阻，以至于ThyA缺失株不能在體外環(huán)境中生長[6-7]。除非在培養(yǎng)基中添加胸腺嘧啶或胸苷，或?qū)牒型暾鸗hyA基因野生型序列的互補質(zhì)粒后，才能使其生存。ThyA基因的上述特點使其成為篩選標(biāo)志基因。

研究證實，在同源重組的染色體整合中，同源片段越長，整合頻率越高，通常情況下，只要達到300 bp的同源片段的同源重組是完全可以成功的[8]。因此，本研究擴增了L.lactis MG1363染色體ThyA基因起始密碼上游和終止密碼下游各約1000 bp的基因序列作為同源片斷，從而提高外源基因在乳酸菌染色體中的整合效率。同時在引物序列中引入6個酶切位點（KpnⅠ、Aor3HⅠ、FseⅠ、BamHⅠ、Sse8387Ⅰ、XhoⅠ），作為同源重組載體的多克隆位點，可根據(jù)研究的需要插入不同目的基因在乳酸菌染色體上進行同源重組。pThyA-updown也可攜帶目的基因在含ThyA基因的其他細(xì)菌中進行染色體整合。

在下一步研究中，我們擬利用攜外源基因的同源重組載體pThyA-up-down，通過雙交叉同源重組，替換乳酸菌基因組中的ThyA基因，實現(xiàn)目的基因在乳酸菌中的整合型表達，而不引入抗藥性基因和其他外源基因，使得插入的外源DNA片斷最小化，并且不會發(fā)生外源基因的水平轉(zhuǎn)移，因此這種乳酸菌同源重組載體具有較高的生物安全性，可望安全有效地應(yīng)用于相關(guān)疾病的防治。

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