張繼榮

湖南省腫瘤醫(yī)院（410013）

惡性腫瘤作為一種威脅人類生命健康以及降低生活質(zhì)量的重大疾病，發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第3位[1,2]。由于病變部位的組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜性以及早期診斷手段的不足，卵巢癌的診治一直都是婦科領(lǐng)域的重要研究課題。盡管腫瘤細胞減滅術(shù)以及聯(lián)合鉑類藥物為基礎(chǔ)化療的綜合治療一定程度上能夠緩解病痛，降低該類腫瘤患者的病死率。但是卵巢癌的復(fù)發(fā)率以及病死率仍然較高。其中，因為腫瘤細胞耐藥導(dǎo)致的化療失敗是一個及其重要的原因，也是目前卵巢癌治療面臨的難題之一。相關(guān)學(xué)者也在不斷的尋找增加卵巢癌患者對于化療藥物的敏感性的方法[3-5]?？鄥A是從中藥苦參的干燥根中提取的活性物質(zhì)，近年來的研究結(jié)果表明苦參堿在抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤細胞黏附與浸潤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了重要作用。近年來，調(diào)控細胞增殖與凋亡的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB以及相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在各種抗腫瘤的輔助治療中的作用引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。目前的研究已經(jīng)明確，NF-κB的活性增加與參與凋亡抑制蛋白家族成員的表達量呈現(xiàn)正相關(guān)。其中Livin以及Survivin兩種最新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子與NF-κB活性間的關(guān)系對于理解藥物降低上皮細胞癌發(fā)生率這一現(xiàn)象具有相當(dāng)?shù)睦碚撎接憙r值[6-8]。介于以上背景，筆者提出通過苦參堿抑制處理上皮性卵巢癌細胞，通過下調(diào)NF-κB——Livin、Survivin信號通路，達到增加腫瘤細胞對于順鉑敏感性的理論設(shè)想。本文旨在探討苦參堿干預(yù)與上皮性卵巢癌細胞對順鉑敏感性的關(guān)系，以及觀察NF-κB活性、Livin、Survivin表達量與苦參堿藥物干預(yù)間的聯(lián)系。為上皮性卵巢癌的治療提供借鑒性的信息。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)條件及傳代

OVCAR細胞在含10%小牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1～2d更換培養(yǎng)液1次。細胞傳代方法：待細胞生長至培養(yǎng)基底板面積70%～80%，棄培養(yǎng)液，加2～5mL PBS漂洗2次，棄去。加2～3mL胰酶消化3～5min；鏡下看到細胞收縮變圓，棄消化液，再加3～5mL含小牛血清培養(yǎng)液，用吸管按順序輕輕吹打成細胞懸液，按照1∶2～3比例進行傳代，7℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于實驗。

1.2 主要試劑

噻唑藍（MTT）（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；NF-κB轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒（Cayman公司）；蛋白提取試劑盒（Active Motif公司）；鼠抗人NF-κB一抗（BD公司）；鼠抗人Livin一抗（Alexis公司）；鼠抗人Survivin一抗（Cell Signaling公司）；羊抗鼠二抗（Sigmal公司）。

1.3 MTT法測定細胞對藥物的敏感性

取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后配置成單細胞懸液。實驗設(shè)藥物處理組（加入順鉑藥物）、細胞對照組（不加藥物，只加細胞懸液）及空白對照組（加入培養(yǎng)液）。細胞培養(yǎng)24h后，分別加入0、10、20、25、30、35、40、50和60μmol/L的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。實驗終止前4h，加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，除去每孔中培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL/孔，振蕩數(shù)分鐘使形成晶體完全溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀測定492nm處吸光度值A(chǔ)492，并計算該濃度下抑制率，并使用直線回歸法計算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實驗重復(fù)3次。存活率＝試驗組A492/對照組A492×100%，抑制率＝1－存活率。

1.4 ELISA法測定NF-κB核DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性

應(yīng)用Cayman公司轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒測定NF-κB核DNA結(jié)合活性。細胞培養(yǎng)孔中加入結(jié)合緩沖液90μL以及等量的核蛋白提取液。4℃過夜后用ELISA專用洗液每孔200μL沖洗。加入100μL稀釋后NF-κB一抗，室溫孵育1h，沖洗5次。加入100μL二抗室溫孵育1h，沖洗5次。每孔加入100μL發(fā)光液，室溫避光孵育40min，加入100μL終止液，450nm處讀數(shù)。在陽性對照正常顯色的前提下，計算各組樣本吸光度的平均值，繪制標準曲線，對各組OD值進行比較。

1.5 Western blot法檢測Livin、Survivin蛋白表達

總蛋白提取嚴格按照提取試劑盒說明書操作進行。蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用濕轉(zhuǎn)膜法。采用5%脫脂牛奶封閉后，使用TBST洗膜，分別加入各種一抗，4℃過夜后，加入二抗室溫反應(yīng)1h。洗脫后顯影。根據(jù)預(yù)期相對分子質(zhì)量大小區(qū)域出現(xiàn)的特異性條帶判斷蛋白表達量的高低。應(yīng)用Bio-Rad公司Quantity-one軟件分析。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義差異。

2 結(jié) 果

2.1 苦參堿增加順鉑對上皮性卵巢癌細胞的增殖的抑制作用

上皮性卵巢癌細胞在苦參堿作用后，對順鉑的敏感性均有增加，表現(xiàn)為藥物對細胞的增殖抑制效應(yīng)增加，并且這種抑制效應(yīng)隨濃度的增大而增大。其中，順鉑對10、40、160μmol/L苦參堿處理的3組細胞的IC50分別為（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，順鉑對對照組細胞的IC50為（31.65±2.23）μmol/L。具體結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度順鉑對各組細胞的抑制強度

2.2 苦參堿處理后各組細胞中NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性的變化

圖2 Livin在上皮性卵巢癌細胞中表達的灰度分析

NF-κB核DNA結(jié)合活性檢測結(jié)果顯示，苦參堿處理各組細胞核內(nèi)NF-κB蛋白表達較對照組呈現(xiàn)顯著降低，其中苦參堿（10、40、160μmol/L）處理的3組細胞的NF-κB蛋白表達分別為（0.507±0.027）、（0.375±0.019）和（0.311±0.017），對照組NF-κB蛋白表達為（0.705±0.032）。表明苦參堿處理可以使NF-κB從胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性降低。

2.3 苦參堿處理后各組細胞中Livin、Survivin蛋白表達的變化

Western blot檢測結(jié)果顯示，苦參堿作用于卵巢癌細胞后Livin、Survivin的表達呈濃度依賴性下調(diào)趨勢，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果見圖2。

3 討 論

卵巢惡性腫瘤的病死率居目前婦科生殖道惡性腫瘤病死率的首位，其原因除對其發(fā)生、發(fā)展過程尚缺乏了解外以及難以早期診斷外，治療過程中及易產(chǎn)生的藥物敏感性降低、腫瘤細胞對藥物耐受現(xiàn)象也是目前臨床一個棘手的問題。上皮性癌是最為常見的原發(fā)性卵巢癌，主要治療手段是腫瘤細胞減滅術(shù)輔以鉑類為主的化療。鉑類藥物作為卵巢上皮細胞腫瘤的一線化療藥物已經(jīng)應(yīng)用40余年，耐藥問題也日益突出，致使患者尤其是晚期腫瘤患者的生存率以及生活質(zhì)量受到嚴重的影響。怎樣有效的提高腫瘤細胞對藥物的敏感性成為眾多學(xué)者關(guān)注的問題。最近的研究發(fā)現(xiàn)，化療后NF-κB的活化，可以上調(diào)凋亡抑制蛋白，增前凋亡抵抗，從而導(dǎo)致腫瘤細胞對于化療藥物的拮抗作用。這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變可能是腫瘤細胞化療后藥物敏感性下降的途徑之一?？鄥A作為苦參中的重要活性物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)該成分可以阻止人白血病細胞的增殖周期，該藥物在誘導(dǎo)細胞凋亡的同時可以導(dǎo)致一些重要的細胞因子發(fā)生基因、蛋白水平的改變。該藥物的使用是否可以增加腫瘤細胞對藥物的敏感性以及其中潛在的機制是筆者本次研究探索的目標。

本次研究首先觀察苦參堿處理的細胞是否對順鉑的敏感性有增加的現(xiàn)象發(fā)生。結(jié)果顯示，順鉑對10、40、160μmol/L苦參堿處理的3組細胞的IC50分別為（29.75±5.27）、（25.61±4.27）和（17.29±3.35）μmol/L，順鉑對對照組細胞的IC50為（31.65±2.23）μmol/L。提示苦參堿能夠有效的增加腫瘤細胞對順鉑藥物的敏感性。并且這種增敏現(xiàn)象有著劑量依賴性。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB核DNA結(jié)合活性檢測結(jié)果顯示，苦參堿處理各組細胞核內(nèi)NF-κB蛋白表達較對照組呈現(xiàn)顯著降低。該結(jié)果提示，苦參堿的作用可能是與NF-κB介導(dǎo)的凋亡抑制現(xiàn)象有關(guān)。

同時，本次研究重點關(guān)注NF-κB介導(dǎo)凋亡抑制信號通路中兩個重要的蛋白Livin、Survivin的表達情況。結(jié)果顯示上述兩種凋亡抑制蛋白的表達量在苦參堿處理后均呈現(xiàn)明顯的下調(diào)現(xiàn)象。因此，筆者認為苦參堿增加上皮性卵巢癌細胞的敏感性現(xiàn)象可那與其抑制NF-κB活性，阻斷凋亡抑制蛋白Livin、Survivin蛋白的表達，誘導(dǎo)細胞的凋亡現(xiàn)象有關(guān)。

本此研究將NF-κB及其信號通路為觀察對象。NF-κB作為一種與腫瘤細胞凋亡關(guān)系密切的功能蛋白，研究其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與順鉑藥物敏感性的關(guān)系，對于我們擴展腫瘤治療的思路，預(yù)測細胞對藥物的敏感性有著積極的借鑒意義。

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