曾憲莉，趙紅宇，軒東英，趙 華，王春先，周東風(fēng)，章錦才

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院鄭州450052 2)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院;廣東省口腔醫(yī)院番禺分院番禺511400 3)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院;廣東省口腔醫(yī)院廣州510280

隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，模擬牙釉質(zhì)的礦化過程，生產(chǎn)出具有再礦化能力的生物義齒成為國內(nèi)外研究的熱點。釉原蛋白(amelogenin，AMEL)是釉質(zhì)有機(jī)基質(zhì)的主體，為釉質(zhì)生物礦化提供必要的支架。非釉原蛋白包括釉蛋白和成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)等也被認(rèn)為具有較廣泛的促進(jìn)晶體成核和影響晶體生長形態(tài)的作用［1］。1，25-二羥維生素 D3［1，25-(OH)2D3］作為維生素 D甾體類激素的活化形式，對細(xì)胞生長、分化及蛋白質(zhì)的分泌等起著重要的調(diào)控作用［2-3］，其受體在口腔組織中分布廣泛，其中成釉細(xì)胞是維生素D的靶細(xì)胞之一［4-5］。作者擬通過體外培養(yǎng)豬成釉細(xì)胞，應(yīng)用Western blot法檢測不同濃度1，25-(OH)2D3對豬成釉細(xì)胞所分泌的特異性蛋白AMEL和AMBN的影響，為牙釉質(zhì)生物礦化的研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青、鏈霉素 (美國Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、ABC型免疫組化檢測試劑盒、鼠抗人波形絲蛋白多克隆抗體和鼠抗人角蛋白多克隆抗體(美國博士德公司)，1，25-(OH)2D3和兔抗人AMEL多克隆抗體(美國 Sigma公司)，羊抗豬AMBN單克隆抗體、鼠抗豬β-actin單克隆抗體和Brandford蛋白定量試劑盒(美國Santa Cruz公司)。

1.2 豬成釉細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 選擇約6個月齡30 kg體質(zhì)量的西藏小型豬(購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心)注射過量氯胺酮處死后消毒，取上下頜骨，于無菌條件下切開牙槽黏膜，去除頰側(cè)牙槽骨，分離取出磨牙牙胚，置于pH 7.2的PBS中2 h。PBS沖洗3次，分離牙囊、牙乳頭及成釉器。將成釉器組織剪碎成1 mm3大小的組織塊，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入少量含體積分?jǐn)?shù)10%FBS，青、鏈霉素各100 kU/L和體積分?jǐn)?shù)1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打均勻，組織塊法接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞生長至90%融合時傳代。傳代后制作細(xì)胞爬片，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并行間接法免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鏡下觀察AMEL、角蛋白、波形絲蛋白的表達(dá)。

1.3 實驗分組 將1，25-(OH)2D3用含體積分?jǐn)?shù)1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(1×10－10、1 × 10－8和 1 × 10－6mol/L)，以含體積分?jǐn)?shù)1%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液作對照。取第2代豬成釉細(xì)胞以1×106mL－1的密度接種至12個75 cm2培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，用無血清的DMEM/F12洗1次，分4組，分別加入上述配制好的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每組3瓶。

1.4 豬成釉細(xì)胞AMEL和AMBN的檢測 采用Western blot法。各組分別在加藥后1、3及5 d取出1瓶樣本，用含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑提取豬成釉細(xì)胞總蛋白，用Brandford蛋白質(zhì)定量試劑盒測定樣品濃度。對提取的總蛋白行SDS-PAGE電泳，以檢測AMEL和AMBN的表達(dá)變化，β-actin作為內(nèi)參。30 mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)移過夜。膜在體積分?jǐn)?shù)5%BSA溶液中室溫孵育1 h，加入一抗(AMEL和AMBN一抗工作濃度均為1∶100)室溫孵育1.5 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法檢測。圖片用Quantity One分析軟件(芬蘭Biohit公司)處理，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值的比值代表目的蛋白的相對含量，實驗重復(fù)4次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行分析，各組間蛋白質(zhì)相對含量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 豬成釉細(xì)胞的鑒定結(jié)果 豬成釉細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形或多角形。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，豬成釉細(xì)胞角蛋白染色陽性(胞質(zhì)呈棕黃色)，而波形絲蛋白染色陽性(胞質(zhì)無著色)，表明該細(xì)胞為上皮來源;AMEL抗體染色陽性(胞質(zhì)呈棕黃著色)，表明該細(xì)胞為成釉細(xì)胞，見圖1。

圖1 豬成釉細(xì)胞形態(tài)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(×400)

2.2 豬成釉細(xì)胞分泌AMEL和AMBN的相對含 量 見圖2和表1、2。

圖2 各組不同時間點豬成釉細(xì)胞分泌的AMEL(左)及AMBN(右)

表1 各組不同時間點豬成釉細(xì)胞分泌AMEL的相對含量

表2 各組不同時間點豬成釉細(xì)胞分泌AMBN的相對含量

3 討論

成釉細(xì)胞是具有特殊功能的終末分化細(xì)胞，能分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，調(diào)節(jié)釉質(zhì)基質(zhì)的形成和礦化［6］。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)維生素D受體在口腔組織中分布廣泛，成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞是維生素D的靶細(xì)胞。

AMEL和AMBN是釉質(zhì)生物礦化的關(guān)鍵蛋白，1999 年 Papagerakis等［9］發(fā)現(xiàn) AMEL 的表達(dá)受1，25-(OH)2D3調(diào)控，這是對激素調(diào)控牙齒特定基因表達(dá)的首次報道。2002年P(guān)apagerakis等［10］的研究結(jié)果表明，幾種蛋白協(xié)同作用形成牙齒的過程可能受1，25-(OH)2D3的調(diào)控。

作者的研究結(jié)果顯示:不同濃度的 1，25-(OH)2D3作用后，豬成釉細(xì)胞AMEL的分泌量隨作用時間的延長和藥物濃度的增加而增加，AMBN的分泌量隨作用時間的延長而增加，隨藥物濃度的增加而減少。提示1，25-(OH)2D3是一種生物誘導(dǎo)分化劑，它通過促進(jìn)成釉細(xì)胞AMEL的分泌和抑制成釉細(xì)胞AMEN的分泌，進(jìn)而影響成釉細(xì)胞參與牙釉質(zhì)的礦化過程。

總之，作者認(rèn)為成釉細(xì)胞分泌AMEL和AMBN受1，25-(OH)2D3調(diào)控，但 1，25-(OH)2D3是通過何種信號通路影響這些蛋白的表達(dá)，需進(jìn)一步探索研究。

［1］Habelitz S，Kullar A，Marshall SJ，et al.Amelogenin-guided crystal growth on fluoroapatite glass-ceramics［J］.J Dent Res，2004，83(9):698

［2］Lemire JM.Immunomodulatory actions of1，25-dihydroxyvitamine D3 ［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1995，53(1/6):599

［3］Bikle DD.Clinical counterpoint:vitamine D:new actions，new analogs，new therapeutic potential［J］.Endocr Rev，1992，13(4):765

［4］Tetlow LC，Woolley DE.The effects of 1α，25-dihydroxyvitamin D(3)on matrix metalloproteinase and prostaglandin E(2)production by cells of the rheumatoid lesion［J］.Arthritis Res，1999，1(1):63

［5］Stumpf WE.Vitamin D and the digestive system［J］.Eur J Drug Metab Pharmacokinet，2008，33(2):85

［6］Robinson C，Brookes SJ，Shore RC，et al.The developing enamel matrix:nature and function［J］.Eur J Oral Sci，1998，106(Suppl 1):282

［7］Robinson C，Kirkham J，Briggs HD，et al.Enamel proteins:from secretion to maturation［J］.J Dent Res，1982，12(9):1 490

［8］Smith EL，Walworth NC，Holick MF.Effect of 1 alpha，25-dihydroxyvitamin D3 on the morphologic and biochemical differentiation of cultured human epidermal keratinocytes growth in serum free conditions［J］.J Invest Dermatol，1986，86(6):709

［9］Papagerakis P，Hotton D，Lezot F，et al.Evidence for regulation of amelogenin gene expression by 1，25-dihydroxyvitamin D(3)in vivo［J］.J Cell Biochem，1999，76(2):194

［10］Papagerakis P，MacDougall M，Berdal A.Differential epithelial and mesenchymal regulation of tooth-specific matrix proteins expression by 1，25-dihydroxyvitamin D3 in vivo［J］.Connect Tissue Res，2002，43(2/3):372