巴玉峰，宋一民，李 印#，張紅新，李素紅，陳奎生，張云漢

1)河南省腫瘤醫(yī)院胸外科鄭州450003 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科;河南省腫瘤病理重點實驗室鄭州450052

淋巴道轉(zhuǎn)移是人食管癌轉(zhuǎn)移的主要方式，且與患者的預后密切相關［1］。血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial factor C，VEGF-C)可誘導淋巴管增生，促進腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移，被稱為特異性的淋巴管 生 成 因 子［2］。RNA 干 擾 (RNA interference，RNAi)是一種新興的基因治療技術，具有高效性和高度特異性［3］。作者構(gòu)建了以人VEGF-C基因為靶標的小分子干擾RNA(siRNA)質(zhì)粒，經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細胞，并移植于裸鼠皮下形成移植瘤，觀察移植瘤組織中VEGF-C的表達情況，為進一步探討食管癌淋巴道轉(zhuǎn)移機制及以抗淋巴管生成為靶點的食管癌基因治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌EC9706細胞系(中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈)。T細胞免疫缺陷的BALB/c SPF SR雌性裸鼠25只(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供)，鼠齡4～6周，體質(zhì)量18～22 g。Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR一步法試劑盒(TaKaRa公司)，RT-PCR引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。VEGFC兔抗人多克隆抗體和SP免疫組化試劑盒均為北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品。RPMI 1640(海克隆生物化學制品北京有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)為同濟醫(yī)科大學千屏影像工程公司產(chǎn)品。馮氏IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具(蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司)。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞 根據(jù)VEGF-C cDNA已知序列(NM_005429)，參照文獻［4］的方法，利用Ambion和TaKaRa等公司網(wǎng)站提供的設計分析軟件，設計并體外轉(zhuǎn)錄合成3條含19個核苷酸的siRNA(HX1、HX2和 HX3)和1條無關序列 siRNA(HX4)，序列見表1。

表1 寡核苷酸序列

導入pSINsi-U6載體，得到發(fā)卡樣siRNA表達重組質(zhì)粒。重懸EC9706細胞于RPMI 1640培養(yǎng)液中，以每孔5×105個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h使之貼壁生長，當融合達90%時，參照脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分組進行轉(zhuǎn)染，分別是空白對照組(僅加脂質(zhì)體)、pSINsi-U6-HX1組、pSINsi-U6-HX2組、pSINsi-U6-HX3組、無關序列轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，換含800 mg/L G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)進行抗性篩選，1周內(nèi)空白對照組和未轉(zhuǎn)染對照組細胞全部死亡，其余各組也有80% ～90%的細胞死亡，換用含400 mg/L G418培養(yǎng)液篩選抗性克隆至2周后，挑選陽性克隆，傳代至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)常規(guī)擴大培養(yǎng)。

1.3 裸鼠移植瘤模型的建立 裸鼠隨機分為5組，分別為HX-1、2、3轉(zhuǎn)染組和無關序列轉(zhuǎn)染組以及未轉(zhuǎn)染對照組。將1.2中轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒的各組EC9706細胞傳代并常規(guī)擴大培養(yǎng)，2 g/L胰蛋白酶消化、吹打、無菌生理鹽水重懸制成細胞懸液，注射于裸鼠腋窩皮下(2×106個/只)，動物接種后3～5 d即可見到明顯腫塊突起，SPF環(huán)境中飼養(yǎng)4周后處死。

1.4 觀測指標

1.4.1 移植瘤體積和質(zhì)量測定 頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，剝離移植瘤，洗凈并稱量。

1.4.2 移植瘤組織中VEGF-C蛋白檢測 采用免疫組化SP法測定，按照試劑盒說明操作。取移植瘤組織，常規(guī)制片，依次滴加工作液和VEGF-C多克隆抗體(稀釋度為1∶150)，中止反應后蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，并按說明書推薦的結(jié)腸癌標本作陽性對照。VEGF-C蛋白陽性染色為淡黃色或棕深黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)內(nèi)。每組切片用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)在高倍視野下計數(shù)10個視野，并避開移植瘤壞死區(qū)域，對腫瘤細胞進行體視學參數(shù)——陽性單位(positive unit，PU)測定。PU越大，表示目標物陽性表達強度越高;反之，表達強度越低［5］。

1.4.3 移植瘤組織中VEGF-C mRNA檢測 用Trizol提取移植瘤組織總RNA，RT-PCR檢測各組細胞中VEGF-C mRNA 的方法參照文獻［6］，VEGF-C 引物序列:上游 5’-AAGGAGGCTGGCAACATAAC-3’，下游5’-CCACATCTGTAGACGGACAC-3’，擴增產(chǎn)物大小 229 bp;β-actin引物序列:上游 5’-CATCCT GCGTCTGGACCT-3’，下游 5’-TCAGGAGGAGCAAT GATCTTG-3’，擴增產(chǎn)物大小480 bp。目的基因與內(nèi)參照物引物同管擴增，按以下條件進行RT-PCR反應:50℃ 30 min，94℃預變性2 min，94℃變性30 s，57.8 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共進行 35 個循環(huán)。取5 μL擴增產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混勻，在12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以VEGF-C與β-actin條帶灰度值的比值表示目的片段的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0進行統(tǒng)計分析。對5組移植瘤體積、質(zhì)量、VEGF-C蛋白的 PU及mRNA相對表達量進行正態(tài)性、方差齊性檢驗及單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 5組移植瘤體積及質(zhì)量的比較 見表2。

2.25 組移植瘤組織中VEGF-C mRNA的表達見圖1、表2。

圖1 移植瘤組織中VEGF-C mRNA的表達

2.3 5組移植瘤組織中VEGF-C蛋白的表達 見圖2與表2。

圖2 移植瘤組織中VEGF-C蛋白的表達(SP，×400)

表2 5組移植瘤體積、質(zhì)量、VEGF-C mRNA及蛋白測定結(jié)果(n=5)

3 討論

RNAi是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，可以破壞特定目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，使其功能沉默，而對其他正?；驘o影響。RNAi應用不僅為基因功能研究提供了簡單有效的“基因敲除”手段，同時還為病毒感染性疾病、遺傳性疾病及腫瘤的基因治療開辟了新途徑［7］。

近年來，國內(nèi)對于VEGF-C與食管鱗狀細胞癌淋巴道轉(zhuǎn)移關系的研究開展較多，均認為食管鱗狀細胞癌組織中VEGF-C的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關系密切，且呈正相關［6，8-9］。謝曉斌等［10］應用靶向 VEGF-C 的短發(fā)夾RNA(shRNA)對乳癌細胞生物學特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)VEGF-C shRNA重組質(zhì)粒載體在乳癌MCF-7細胞中能高效、特異地發(fā)揮靶基因沉默作用。

作者將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF-C siRNA表達質(zhì)粒的食管癌EC9706細胞注射于裸鼠皮下，成功構(gòu)建了移植瘤，并用RT-PCR、免疫組化和體視學技術證明，轉(zhuǎn)染靶向VEGF-C的siRNA表達載體的EC9706細胞形成的移植瘤組織中VEGF-C mRNA和蛋白表達受抑，尤其是HX2轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中不僅有VEGF-C蛋白與mRNA的表達下調(diào)，瘤組織體積和質(zhì)量也均有所減小，可能是由于VEGF-C系VEGF家族成員，該段序列與VEGF-A同源，從而發(fā)揮了抑制生長的生理功能，這也為針對VEGF-C的RNAi提供了一種新思路。HX1、2、3轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中仍可檢出VEGF-C mRNA弱表達，可能與所用RNAi質(zhì)粒沉默VEGF-C mRNA表達的效率達不到100%有關。

總之，從體內(nèi)實驗的角度證實，設計和構(gòu)建的抗VEGF-C表達的siRNA載體可有效抑制食管癌EC9706細胞產(chǎn)生VEGF-C的特性，為食管癌抗淋巴管生成的基因治療提供了理論依據(jù)。

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［6］張紅新，張嵐，賀付成.人食管鱗癌中血管內(nèi)皮生長因子C mRNA的表達及其臨床意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2006，16(24):3 697

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［10］謝曉斌，龍捷，楊芳，等.靶向血管內(nèi)皮生長因子C短發(fā)夾式RNA對人乳腺癌MCF-7細胞生物學特性的影響［J］.中華病理學雜志，2009，38(7):472