呂永恒,陳 琪,黎洪展,黃光勝

(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中西醫(yī)結(jié)合臨床教研室,廣州510315)

目前研究認為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)過程不僅是脂質(zhì)在動脈壁中的積聚,而是一種慢性炎癥疾病[1],也有學者提出AS是一種自身免疫性疾病[2]。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的專職性抗原提呈細胞,在特異性細胞免疫和體液免疫中均起著十分重要的作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)DC在AS斑塊中聚集增多,提示其免疫機制可能參與了AS的發(fā)生和發(fā)展,抑制免疫炎癥反應可能是抗AS的新途徑[4]。臨床及實驗證實,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)的應用可部分逆轉(zhuǎn) AS或?qū)?AS起到預防作用,但其機制尚未完全明確,ACEI對炎癥反應的抑制可能是其中之一[5]。目前ACEI對DC的作用尚少有報道。本研究探討了AS大鼠DC的功能狀態(tài),為DC參與AS的病理過程提供實驗依據(jù),并觀察了ACEI類藥物依那普利(Enalapril)對大鼠樹突狀細胞功能的影響,以進一步闡明ACEI對免疫功能的可能影響以及ACEI防治AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640(L-glutamine)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司;四唑鹽(M TT)、二甲亞砜(DSMO)購自廣州威佳公司;重組鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組鼠白介素-4(rmIL-4)購自英國Peprotech公司;PE antimouse CD86(B7-2)單抗購自 Biolegend公司;IL-1β、TNF-α試劑盒購自深圳晶美公司;依那普利購自常州制藥廠;Wistar大鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠AS模型 雄性Wistar大鼠30只,體質(zhì)量(210±10)g,隨機分為3組,正常對照組(n=10);AS組(n=10),口服依那普利組(n=10)。大鼠分組后,飼以不同飲食,正常對照組為普通飲食;AS組飼以高脂飲食(參照文獻[6]方法造模,其飼料配制是:4%膽固醇、10%豬油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86%基礎(chǔ)飼料,基礎(chǔ)飼料中面粉 20%、米粉 2%、玉米20%、麩皮25%、豆料20%、骨粉 2%、魚粉2%);口服依那普利組飼以高脂飲食同時予蒸餾水灌胃法飼以依那普利0.5 mg?kg-1?d-1,4周后實驗。

1.2.2 DC制備 抽取大鼠靜脈血20 mL,淋巴細胞分離液中離心(2 000 r/min,20 min),收集單個核細胞(PBMC),PBS液沖洗2次,RPMI1640沖洗1次,用完全RPM I1640培養(yǎng)基(含10%FBS)在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2 h(37℃、5%CO2),吸除非貼壁細胞。貼壁細胞用完全 RPMI1640培養(yǎng)基(含10%FBS、rmGM-CSF 100 ng/mL、rmIL-4 500 u/mL),置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,24 h換液1次。收集第7天的懸浮細胞即DC進行實驗。

1.2.3 DC形態(tài) 于培養(yǎng)第 1、3、5、7天在倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)。

1.2.4 流式細胞學分析 收集DC細胞,用PE標記的CD86(B7-2)單抗標記細胞,用流式細胞儀(FACS,美國 BectonDickinson)檢測。

1.2.5 混合淋巴細胞反應(M LR)反應中T淋巴細胞來自其他大鼠的PBM C,經(jīng)尼龍毛柱分離后,得到純的T淋巴細胞。濃度為2×105/mL的T淋巴細胞與濃度為2×104/mL的DC各100μ L在96孔平底培養(yǎng)板中37℃、5%CO2條件下混合培養(yǎng),第4天吸取上清液,-20℃凍存?zhèn)錅y細胞因子,沉淀細胞加M TT液(25 μ L/孔),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后每孔加DMSO100 μ L,波長570 nm處測 A值(代表刺激 T淋巴細胞增殖能力)。

1.2.6 細胞因子測定 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)分別檢測保存的MLR上清液細胞因子 IL-1β和TNF-α濃度,操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS10.0軟件系統(tǒng)分析,所有資料采用表示,組間差異采用單向方差分析(One-way ANOVA),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DC形態(tài)學特點 本研究借鑒前人經(jīng)驗[7],成功培養(yǎng)出DC并進行鑒定,培養(yǎng)第7天的 DC表達 CD1а陽性率為92%。光學顯微鏡下可見細胞表面伸出樹突樣結(jié)構(gòu),長短不一,呈簇狀生長,為典型的DC形態(tài)。3組DC形態(tài)無差異。

2.2 CD86表達率 結(jié)果顯示,DC培養(yǎng)第7天,AS組DC表面CD86表達明顯高于對照組(P＜0.001);AS經(jīng)應用依那普利干預組的DC表面CD86表達明顯低于AS組(P＜0.001)(見表1)。

2.3 M LR AS組DC刺激T細胞增殖的能力明顯高于對照組DC(P＜0.001);AS經(jīng)應用依那普利干預組DC刺激T細胞增殖的能力明顯低于AS組DC(P＜0.001)(見表1)。

表1 依那普利對DC功能的影響

表1 依那普利對DC功能的影響

與正常對照組比較,*:P＜0.001;與AS組比較,**:P＜0.001。

組別 CD86表達率(%)A值正常對照組 50.80±9.73 0.63±0.07 AS組 81.65±6.65* 1.18±0.27*口服依那普利組 59.40±9.95** 0.72±0.16**

2.4 細胞因子測定 AS組M LR上清液中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α高于對照組(P＜0.001),AS組和依那普利組 MLR上清液中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α低于 AS組(P＜0.001)(見表2)。

表2 MLR上清液中細胞因子濃度(pg/mL

表2 MLR上清液中細胞因子濃度(pg/mL

與正常對照組比較,*:P＜0.001;與AS組比較,**:P＜0.001。

組別 IL-1β TNF-α正常對照組 13.4±5.12 9.5±2.18 AS組 22.2±4.40* 18.2±6.52*口服依那普利組 15.6±5.38** 13.6±5.88**

3 討 論

目前研究認為免疫機制參與了AS的發(fā)生發(fā)展,在AS斑塊中有大量免疫炎性細胞如T淋巴細胞、巨噬細胞等[8]。最近發(fā)現(xiàn)在AS斑塊中DC亦聚集增多[4]。DC是體內(nèi)效應最強的專職性抗原呈遞細胞,原始T細胞被激活的前提是DC提呈的MHC抗原的識別[9-10],以及共刺激分子CD86(B7-2)與其在T細胞表面的受體CD28的配對[11],共刺激分子的缺乏可誘導特異性T淋巴細胞的免疫耐受,使局部炎性細胞對特異性抗原無反應[12]。

已有研究表明[13-14],ACEI具有抗AS作用。ACEI是通過抑制循環(huán)和組織局部的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)使血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平降低而發(fā)揮效應的。研究表明,幾乎所有的RAS成分均在免疫細胞中表達,AngⅡ可以由免疫細胞產(chǎn)生并直接作用于免疫細胞,通過自分泌方式調(diào)節(jié)免疫細胞功能,干預RAS可以調(diào)節(jié)T淋巴細胞的增生、凋亡,甚至抗原遞呈細胞的抗原遞呈作用;在體內(nèi),ACEI類藥物卡托普利對一些免疫介導的疾病有保護作用,如心肌炎、慢性移植排斥反應等,說明ACEI對免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用。有研究認為AngⅡ及其受體在DC中有高表達,AngⅡ可能介導了先天及獲得性免疫反應的起始過程[15]。Danilov等[16]研究認為ACE可能參與了DC抗原的提呈。以上研究結(jié)果提示ACEI可能對DC的作用有一定影響。但其具體作用目前尚未見報道。本研究結(jié)果表明,DC在AS時處于激活狀態(tài)。表現(xiàn)在DC表面共刺激分子CD86表達的明顯升高,對同種異體T淋巴細胞的促增殖能力增強,T淋巴細胞分泌炎性因子增加。由于DC刺激同種異體T淋巴細胞增殖作用的強度與其表面共刺激分子表達有關(guān),共刺激分子表達率越高,對T淋巴細胞的刺激能力越強[17],因而AS時可能通過DC表面CD86等共刺激分子的差異表達,從而使抗原遞呈功能增強,T淋巴細胞過度活化,激活局部免疫反應。

本研究結(jié)果顯示,應用依那普利并不影響單個核細胞向DC的分化,但可抑制AS大鼠DC表面共刺激分子CD86的表達,從而抑制其成熟和抗原呈遞功能。經(jīng)依那普利處理的DC對同種異體T淋巴細胞的促增殖能力下降,從而避免了T細胞在局部的聚積,同時促炎性因子分泌明顯減少。低表達CD86的DC可誘導特異性T淋巴細胞的免疫耐受,使局部炎性細胞對特異性抗原無反應[11]。低表達CD86的DC誘導T淋巴細胞分泌活動降低,表現(xiàn)在促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α等分泌減少,通過抑制局部平滑肌增生,單核巨噬細胞的聚集、泡沫細胞的形成等作用,影響AS的發(fā)生發(fā)展過程[18]。由于DC對損傷抗原提呈不足,相應的免疫炎性反應受到抑制,對血管壁的損傷相應降低,AS斑塊的穩(wěn)定性增加,動脈斑塊進展得以減緩,從而延緩了AS的進展過程。本實驗結(jié)果表明,ACEI可通過降低DC表面共刺激分子的表達從而抑制DC介導的免疫炎性反應,進一步達到干預AS的發(fā)生與發(fā)展的目的?；贏CEI對ACE及AngⅡ的影響,推測此作用的機制可能是ACEI通過拮抗DC細胞內(nèi)的ACE,細胞內(nèi)AngⅡ水平降低,抑制了DC的抗原提呈能力,甚至引起T淋巴細胞的免疫耐受,從而抑制了DC引起的免疫損傷反應。但其確切機制尚需進一步研究。

綜上所述,作為最強的抗原提呈細胞,DC介導的免疫機制參與了AS的發(fā)生與發(fā)展,ACEI對DC的抑制可能是其抗AS的機制之一。但DC參與AS發(fā)病的具體過程,AS時DC激活,遷移以及ACEI對其影響的機制等需要深入的研究探討。

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