王 平,彭賢貴,陳幸華,劉思恒,張 曦,孔佩艷

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院血液科,重慶400037)

白血病是造血干細(xì)胞突變所致的克隆性惡性腫瘤,染色體分析可以揭示其克隆標(biāo)志,細(xì)胞遺傳學(xué)較細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)表型更能反映白血病的生物學(xué)特征。半數(shù)以上急性白血病患者可檢出克隆性染色體異常,其中,特異性染色體重排與特定的白血病亞型相關(guān)。細(xì)胞遺傳學(xué)改變是影響白血病預(yù)后的因素[1-2]。急性髓細(xì)胞白血病(AM L)部分成熟型的M2b亞型是中國(guó)學(xué)者于20世紀(jì)50年代末提出的,具有髓外浸潤(rùn)率高、治療反應(yīng)好、完全緩解率高、緩解期長(zhǎng)等特點(diǎn)。其特異性遺傳標(biāo)志為8號(hào)與21號(hào)染色體的長(zhǎng)臂在二區(qū)二帶斷裂并相互移位[t(8;21)(q22;q22)],AM L1基因重排可作為診斷本病的分子標(biāo)志[3]。作者在工作中時(shí)常發(fā)現(xiàn)運(yùn)用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)方法檢測(cè)的AM L1/ETO融合基因陽(yáng)性的病例檢測(cè)到異形中幼粒細(xì)胞多少不一,但形態(tài)學(xué)上符合M2b診斷的病例卻很少。2007年10月至2009年4月本院對(duì)收治的66例AML患者進(jìn)行FISH檢測(cè)AML1/ETO融合基因,對(duì)骨髓形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及AM L1/ETO陽(yáng)性結(jié)果分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年10月至2009年4月本院進(jìn)行AML1/ETO檢測(cè)的 AM L患者 66例,其中男37例,女 29例,年齡6～64歲,中位年齡46歲。

1.2 形態(tài)學(xué) (1)取材:于髂后上棘抽取骨髓液先涂片5～8張用于形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色,再抽取1～2 mL用肝素抗凝,用于FISH融合基因檢查。(2)涂片染色:取2張干燥、涂片滿意的骨髓片用瑞氏染液染色10～15 min,油鏡計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞,計(jì)算各種有核細(xì)胞的構(gòu)成比。對(duì)染色不滿意的骨髓片另取1張重新染色。(3)分型標(biāo)準(zhǔn):將核漿發(fā)育明顯不平衡、胞質(zhì)中出現(xiàn)中性顆粒、有核仁的細(xì)胞劃入“異常中幼粒細(xì)胞”,見(jiàn)彩插Ⅱ圖1。AM L形態(tài)學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)內(nèi)分型標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 FISH AM L1/ETO融合基因檢測(cè) (1)探針:采用英國(guó)Cytocell公司雙融合 AM L1/ETO探針,光譜橘紅直接標(biāo)記ETO和光譜綠色直接標(biāo)記AML1。(2)方法:廠商提供的操作方法略加修改,簡(jiǎn)述如下:①1～2 mL肝素抗凝骨髓血2 500 r/min離心8 min去上清液,加8 mL 0.075 M KCl 30 min;②1 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)吹打混勻1 800 r/min離心8 min去上清液;③6 mL固定液,吹打混勻1 800 r/min離心8 min去上清液,重復(fù) 2～3次;④樣本制備、滴片;⑤2×SSC,70%、85%、100%乙醇各2 min;⑥10 μ L探針,18×18蓋玻片,封片膠封片;⑦雜交儀:變性72℃2 min,雜交37℃至少16 h;⑧去蓋玻片,0.3 NP40、0.4 SSC 72 ℃2 min,0.1 NP40、2 SSC 37℃30 s;⑨10 μ L DAPⅡ加蓋玻片暗視野熒光顯微鏡觀察。(3)結(jié)果判斷:用配有DAPI/FITC/TRITC三色激發(fā)塊的O-lympus BX51熒光顯微鏡檢查雜交信號(hào),用Olympus PM30顯微照相機(jī)進(jìn)行照相。正常間期細(xì)胞出現(xiàn)2橘紅2綠色分散熒光信號(hào),出現(xiàn)2黃色1橘紅1綠色信號(hào)為AM L1/ETO陽(yáng)性細(xì)胞,每個(gè)樣本觀察500個(gè)間期細(xì)胞并觀察中期分裂相。

表1 66例AM L形態(tài)學(xué)診斷及AM L1/ETO[t(8;21)(q22;22)]融合基因結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué) 66例AML骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型結(jié)果見(jiàn)表1。在AM L1/ETO融合基因陽(yáng)性病例中,首次化療完全緩解(CR)率 78.4%(9例AML-M2a、8例 AM L-M2b及 1例 MDSRAEB-Ⅱ),4例AML-M2a 2次化療CR,1例 AML-M2a 5次化療仍NR。

2.2 FISH AML1/ETO融合基因檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)彩插Ⅱ圖2、表2。光譜橘紅標(biāo)記ETO和光譜綠色標(biāo)記AML1信號(hào)明晰,正常間期細(xì)胞2橘紅2綠色分散熒光信號(hào),AM L1/ETO陽(yáng)性細(xì)胞2黃色1橘紅1綠色信號(hào)。

表2 AM L1/ETO+融合基因與異形中幼粒細(xì)胞比例構(gòu)成

3 討 論

AM L1/ETO融合基因主要見(jiàn)于白血病M2b亞型,M2b與國(guó)際上的[t(8;21)]M2是同一亞型,其特異性遺傳標(biāo)志為8號(hào)與21號(hào)染色體的長(zhǎng)臂在二區(qū)二帶斷裂并相互移位[t(8;21)(q22;q22)],形成AML1/ETO融合基因[5]。急性髓系白血病的其他亞型如M1、M4、MDS-RAEB-1等也有少數(shù)病例表達(dá)此融合基因[6-8]。本組形態(tài)學(xué)診斷 AML-M 2b病例均表達(dá)AM L1/ETO融合基因(陽(yáng)性率71%～95%),部分AML-M2a、MDS-RAEB亦表達(dá)AML1/ETO融合基因(陽(yáng)性率27%～94%)?；仡櫡治鯝M L1/ETO陽(yáng)性病例骨髓涂片,都能檢測(cè)到異形中幼粒細(xì)胞(表2)。AML1/ETO[t(8;21)(q22;q22)]融合基因改變一定伴隨異形中幼粒細(xì)胞表達(dá),但異形中幼粒細(xì)胞與融合基因表達(dá)也有不一致性。本組融合基因陽(yáng)性率(27%～95%)明顯高于異形中幼粒細(xì)胞比例(4.5%～71.5%),基因表達(dá)先于骨髓形態(tài)表現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)在臨床中形態(tài)學(xué)診斷AML-M2b明顯低于AML1/ETO融合基因檢測(cè)陽(yáng)性率,AM L-M2b臨床診斷明顯較低,其原因可能:(1)AML-M2b主要由形態(tài)學(xué)界定,其原始粒細(xì)胞明顯診斷,以異形中幼粒細(xì)胞增生為主并比例大于30%[7];(2)國(guó)內(nèi)外報(bào)道急性髓細(xì)胞白血病其他亞型如M1、M4、M5等少數(shù)病例也表達(dá) AML1/ETO融合基因[6-8]。在這部分病例可能伴有復(fù)雜核型,[t(8;21)(q22;q22)]不占主導(dǎo)作用;(3)AM L1/ETO融合基因產(chǎn)生一種嵌合蛋白,作為主要的抑制物改變了正常AM L1-CBF(核結(jié)合因子)β這種與造血干細(xì)胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的生理功能[5]。部分AM L-M2a、RAEB-Ⅱ,雖然檢測(cè)到異形中幼粒細(xì)胞但比例小于30%,可能不同白血病細(xì)胞分化程度的不同,部分病例可能為疾病較早期;(4)在M2b形態(tài)診斷中異形中幼粒細(xì)胞辨認(rèn)至關(guān)重要,不同觀察者標(biāo)準(zhǔn)有所不同。綜合張之楠、楊崇禮等[6,9]對(duì)異形中幼粒細(xì)胞描述,本文將核漿發(fā)育明顯不平衡、胞質(zhì)中可見(jiàn)中性顆粒、有核仁的細(xì)胞劃入“異常中幼粒細(xì)胞”。

目前一般認(rèn)為AML1/ETO陽(yáng)性是預(yù)后良好的指標(biāo)之一,但也有報(bào)道預(yù)后中等。劉旭輝等[10]報(bào)道一個(gè)療程化療的CR率(80.6%)高。國(guó)內(nèi)有報(bào)道復(fù)雜核型的[t(8;21)(q22;q22)]復(fù)雜異位的急性髓質(zhì)白血病的實(shí)驗(yàn)研究,在常規(guī)臨床治療中DA化療敏感差[11]。在本組AM L1/ETO融合基因陽(yáng)性病例中,首次化療 CR率達(dá) 78.4%,9例 M 2a、8例 M2b及1例MDS-RAEB-Ⅱ首次化療CR,4例M2a 2次化療CR,1例M2a 5次化療仍NR。出現(xiàn)異形中幼粒細(xì)胞比例高的M2b首次緩解率明顯高于其他的AM L/ETO+AM L。AM L1/ETO融合基因產(chǎn)生的融合蛋白與造血干細(xì)胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的生理功能[5],異形中幼粒細(xì)胞表達(dá)的此類物質(zhì)與化療作用相關(guān)。目前還未見(jiàn)異形中幼粒細(xì)胞與化療敏感度有關(guān)的報(bào)道,由于病例總數(shù)較少、時(shí)間較短,還需要進(jìn)一步觀察與總結(jié)。

[1]張錦海,陳幸華,李波,等.檢測(cè) AML多藥耐藥基因mRNA表達(dá)的多重半巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR方法的建立[J].重慶醫(yī)學(xué),2005,34(12):1812.

[2]曾韞璟,婁世鋒,張萍,等.49例急性白血病細(xì)胞遺傳學(xué)分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(18):2057.

[3]譚齊賢 主編.臨床血液學(xué)和血液檢驗(yàn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:206.

[4]張之楠,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].北京:科學(xué)出版社,1998:171.

[5]Nguyen S,Leblanc T,Fenaux P,et al.A white blood cell index as the main prognostic factor in t(8;21)acute myeloid leukemia(AML):a survey of 161 cases from the French AM L intergroup[J].Blood,2002,99:3517.

[6]楊崇禮,卞壽庚,文偉,等.一種新的FAB急性粒細(xì)胞白血病亞型(M2b)特征的鑒定[J].中華血液學(xué)雜志,1990,11:456.

[7]顧敏曄,熊樹(shù)民.伴有 t(8;21)的急性髓細(xì)胞白血病M-2b型患者的臨床特征(附67例報(bào)告)[J].倫理學(xué)與診斷實(shí)踐,2002,1(2):88.

[8]李承文,蒲麗津,代蕓,等.雙色熒光原位雜交技術(shù)在檢測(cè)t(8;21)白血病中的應(yīng)用[J].中華血液學(xué)雜志,2006,27(1):32.

[9]張之楠,楊天楹,郝玉書(shū).血液病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:869.

[10]劉旭輝,王云貴,梁毅,等.急性髓系白血病AM L1/ETO融合基因檢測(cè)及其臨床意義[J].現(xiàn)代實(shí)踐醫(yī)學(xué)雜志,2005,17(3):136.

[11]張繼紅,王韞秀,張君寧,等.伴 t(2;8;21)(p21;q22;q22)復(fù)雜易位的急性髓系的白血病的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東醫(yī)藥,2009,49(13):39.