李高峰,王宏梅,陳龍華△

(1.廣西柳州市工人醫(yī)院腫瘤科 545005;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科,廣州510515)

原發(fā)性肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、進(jìn)展快、療效差、死亡率高等特點(diǎn),首選的治療手段是手術(shù),但大多數(shù)患者喪失了手術(shù)機(jī)會,放射治療已成為肝癌非手術(shù)治療的重要手段。由于肝細(xì)胞的耐受量低于肝癌細(xì)胞的根治量,且放療中存在的輻射抗拒,導(dǎo)致療效不滿意,為了能夠降低輻射抗性而達(dá)到放療增敏作用,作者以前的研究成功地對HepG2細(xì)胞的 ATM基因進(jìn)行沉默,本研究對 ATM基因沉默的HepG2細(xì)胞進(jìn)行放射,觀察 RNA干擾(RNA interference,RNAi)前后HepG2細(xì)胞的生長情況及放射生物學(xué)參數(shù),評價是否具有放射增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2肝癌細(xì)胞株為南方醫(yī)科大學(xué)病理教研室自存;T RIzol和 LipofectaminTM2000購自 Invitrogen公司;DNAaseⅠ購自上海生工生物公司;Reverse Transcription System試劑盒購自Promega公司,直線加速器:美國Varian公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng);送至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞照射 將指數(shù)生長細(xì)胞用0.25%胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液濃度,然后稀釋成1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL、1×105/mL 4組不同的濃度梯度,分成6組,接種于直徑 9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中,按 0、2、4、6、8、10 Gy 共6個劑量組給予照射,采用varian2100C直線加速器6 MV X線為放射源,源皮距照射,劑量率200 cGy/min,SSD=100 cm,PDD=80%,照射野100 mm×100 mm,并用有機(jī)玻璃進(jìn)行組織補(bǔ)償。每個劑量點(diǎn)3個平行樣本,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 照射后將細(xì)胞置于37℃孵箱,5%CO2進(jìn)行培養(yǎng),連續(xù)10～14 d。終止培養(yǎng)后常規(guī)以PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次,經(jīng)甲醇固定后采用姬姆薩(Giemsa)染液染色,在普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50的細(xì)胞克隆,計(jì)算克隆形成率(克隆形成率=生成的克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)以及存活分?jǐn)?shù)(survival fraction,SF),SF=受照射細(xì)胞的克隆形成率/對照組細(xì)胞克隆形成率×100%。

1.5 放射生物學(xué)參數(shù)的獲取及劑量存活曲線的繪制 以3次照射的存活分?jǐn)?shù)均值進(jìn)行分析,運(yùn)用GraphPad公司Prism 5.0軟件進(jìn)行單擊多靶模型和L-Q線性模型曲線擬合,繪制出劑量存活曲線。根據(jù)單擊多靶模型求出D0、Dq、N和SF2(survival fraction at 2 Gy),其中l(wèi)ogN=Dq/D0,根據(jù)線性二次模型求出α、β、α/β 值及 SF2。放射增敏比(sensitizing enhencement ratio,SER),SER=干擾前組SF2/干擾后組SF2。

表1 HepG2細(xì)胞RNAi前后集落形成率和細(xì)胞存活率(n=3

表1 HepG2細(xì)胞RNAi前后集落形成率和細(xì)胞存活率(n=3

HepG2細(xì)胞 RNAi前HepG2細(xì)胞RNAi后照射劑量(Gy)集落形成率(%)細(xì)胞存活率(%)集落形成率(%)細(xì)胞存活率(%)0 0.230 0 1 0.225 0 1 2 0.205 3±0.000 7 0.892 9±0.003 1 0.177 9±0.003 1 0.785 0±0.004 2 4 0.155 9±0.000 7 0.681 8±0.007 4 0.136 8±0.000 7 0.607 9±0.003 2 6 0.119 7±0.000 2 0.520 4±0.000 9 0.093 0±0.005 4 0.413 2±0.004 0 8 0.063 8±0.000 1 0.277 4±0.000 6 0.045 4±0.000 7 0.201 8±0.003 0 10 0.020 9±0.000 1 0.091 0±0.000 4 0.000 9±0.000 7 0.043 5±0.004 7

2 結(jié) 果

RNAi前后HepG2細(xì)胞經(jīng)過照射后,計(jì)算出各劑量組細(xì)胞集落形成率和細(xì)胞存活率,見表1。將各實(shí)驗(yàn)組得到的數(shù)據(jù)輸入Prism5.0軟件,進(jìn)行單擊多靶模型和L-Q線性模型曲線擬合,繪制出劑量存活曲線見圖1。求出各放射生物學(xué)參數(shù)值α、β 、α/β、D0、Dq 、N 、SF2,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,具體結(jié)果見表 2,最后得到放射增敏比SER=1.137。

表2 HepG2細(xì)胞RNAi前后放射生物學(xué)參數(shù)比較(n=3

表2 HepG2細(xì)胞RNAi前后放射生物學(xué)參數(shù)比較(n=3

Paired-samples T T est α=0.05。

參數(shù) n 干擾前 干擾后 t P SF2 3 0.892 8±0.003 0 0.785 0±0.004 2 1.368 0.230 α 3 0.013 3±0.001 9 0.060 7±0.003 0 2.173 0.082 β 3 0.018 6±0.000 2 0.017 2±0.000 5 2.153 0.084 α/β 3 0.716 3±0.113 4 3.522 0±0.299 1 -3.929 0.011 D0 3 3.370 3±0.031 6 3.505 6±0.059 2-15.395 0.000 Dq 3 1.734 6±0.018 0 1.214 0±0.025 2 -2.865 0.035 N 3 3.272 3±0.074 9 2.221 0±0.065 1 -4.890 0.005

圖1 HepG2細(xì)胞 RNAi前后細(xì)胞存活曲線(L-Q線性二次模型)

3 討 論

野生型ATM位于 11q22～23,有150 kb DNA,66個外顯子,其表達(dá)基因 mRNA長為 13 kb。整個 ATM 基因編碼3 056個氨基酸,相對分子質(zhì)量約350×103。ATM 最主要的功能區(qū)為磷脂酰胺醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K),它位于ATM蛋白C末端。此功能區(qū)主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控,DNA損傷識別和修復(fù)[1]。ATM通過磷酸化和去磷酸化一系列蛋白底物如P53、c2abl(一種非受體酪氨酸激酶)、復(fù)制蛋白A(replication protein A,RPA)等參與激活細(xì)胞周期檢測點(diǎn)和DNA損傷后修復(fù)信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),使受損的DNA停止于細(xì)胞周期檢測點(diǎn)并對其進(jìn)行修復(fù)[2],當(dāng)A TM由于突變而功能受損時,細(xì)胞則喪失這一功能,DNA雙鏈斷裂修復(fù)障礙[3-4],從而出現(xiàn)對放射的高度敏感性。對ATM蛋白在細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路,細(xì)胞周期檢測點(diǎn)以及DNA的修復(fù)的研究可為腫瘤的放射增敏的治療提供新的方法。

DNA雙鏈斷裂(DSB)是放射治療殺死腫瘤細(xì)胞的基本機(jī)制,在人類細(xì)胞內(nèi)有2條DSB的修復(fù)途徑:HR和NHEJ,前者所修復(fù)的DNA片段來自同一條DNA鏈,且末端每一個堿基完全按照互補(bǔ)配對原則進(jìn)行重組修復(fù),而后者所修復(fù)DNA鏈可來自不同的DNA鏈,其末端連接時僅部分堿基結(jié)合即可[5]。ATM與HR的關(guān)系密切,故而ATM基因缺失或表達(dá)受抑制會導(dǎo)致細(xì)胞放射敏感性增高[6-7]。

RNA干擾是在小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的介導(dǎo)下特異性降解相應(yīng)序列mRNA的現(xiàn)象,屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制[8],而siRNA的持續(xù)表達(dá)能引發(fā)更為持久的基因沉默,從而為研究基因功能創(chuàng)造有利條件。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)抑制肝癌 HepG2細(xì)胞的ATM 基因表達(dá)或活性,觀察細(xì)胞對放射線的敏感性變化。

目前集落形成法被認(rèn)為是測定細(xì)胞內(nèi)在輻射敏感性的黃金標(biāo)準(zhǔn),是測定細(xì)胞存活的最可靠方法。L-Q模型定義:假定輻射引起的細(xì)胞死亡是由兩部分組成,一部分與照射劑量成比例,另一部分與照射劑量的平方成比例,用公式表達(dá):SF=EXP(-α D-βD2)。其中α值越大,表明細(xì)胞對輻射越敏感,參數(shù)β的貢獻(xiàn)隨照射劑量增加而加大[9]。本實(shí)驗(yàn)用集落形成法及L-Q模型擬合分析了HepG2細(xì)胞干擾后的輻射敏感性,發(fā)現(xiàn)干擾后的輻射敏感性明顯增加。

D0為曲線斜率倒數(shù),它反映細(xì)胞在相對高劑量區(qū)對射線的敏感性,D0值越大,細(xì)胞對放射越敏感。Dq是存活曲線的直線部分向上延長與通過存活率等于1的橫軸相交點(diǎn)的劑量,表明亞致死損傷修復(fù)能力的大小,Dq小則細(xì)胞對亞致死損傷修復(fù)能力弱。本實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)為:HepG2細(xì)胞干擾前后D0值分別為:3.370 3±0.031 6、3.505 6±0.059 2,Dq值分別為:1.734 6±0.018 0、1.214 0±0.025 2。干擾后 D0、Dq值均較干擾前減小,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明干擾后細(xì)胞的放療敏感性增加。組織的α/β值越低,對損傷修復(fù)能力強(qiáng),反之α/β值越高,對損傷修復(fù)能力弱。HepG2細(xì)胞干擾前后α/β值分別為0.716 3±0.113 4、3.522 0±0.299 1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即 HepG2細(xì)胞 RNAi后的α/β值較前明顯增大,對放射損傷修復(fù)能力減弱,亦說明具有一定的增敏作用。SF2為評價惡性腫瘤細(xì)胞放射敏感性指標(biāo)之一,SF2高,放射敏感性低。HepG2細(xì)胞干擾前后分別為0.892 8±0.003 0、0.785 0±0.004 2,干擾后較干擾前有所降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過計(jì)算放射增敏比值SER為1.137,說明干擾后放射敏感性增高。

總之,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明ATM基因沉默后促進(jìn)了細(xì)胞對X線的敏感性,亦即對肝癌細(xì)胞HepG2具有一定的放射增敏作用。ATM可能成為預(yù)示腫瘤細(xì)胞放射敏感性的指標(biāo),更有可能成為肝癌放療增敏的理想靶點(diǎn),今后還將進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步觀察其放射增敏作用。本研究為肝癌的基因治療和放療增敏提供了新的方法和思路。

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