王居勇,沈惠良,折井久彌,張慶明,四宮謙一

為了增強脊柱手術(shù)后的穩(wěn)定性,臨床通常采用自體骨植入脊柱橫突間,達到脊柱融合。自體髂骨骨塊通常被認為是最好的材料,和其他移植材料相比,自體骨仍作為金標(biāo)準。然而在很多病例,取骨部位的手術(shù)通常會出現(xiàn)一些問題,如增加失血、延長手術(shù)時間、神經(jīng)損傷以及取骨部位感染等[1-2]。另外,也有一些研究報道,應(yīng)用自體骨有30%患者發(fā)生非融合和假關(guān)節(jié)形成[3-4];對于多節(jié)段脊柱融合手術(shù),自體骨資源可能不充分。

近年來,利用骨誘導(dǎo)生長因子來誘導(dǎo)骨形成的研究也很多,尤其是骨形態(tài)蛋白(BMP)。一些研究者應(yīng)用工程材料和rhBMP-2成功得到組織工程骨[5-7],目前多數(shù)研究都是針對破骨細胞的骨吸收和骨形成這一方面[8-9]。然而,大劑量BMP移植入體內(nèi)可能引起意想不到的副作用,這些副作用甚至可能發(fā)生在遠離BMP使用的部位,所以,很多國家還沒有承認BMP的臨床應(yīng)用價值。

最近,很多研究證實種植了骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的多孔人工骨能夠誘導(dǎo)骨形成[10-12]。BMSCs具有多潛能特性,容易提取并且容易培養(yǎng)增殖。Yoshikawa使用Maniatopoulos方法提高了細胞的培養(yǎng)效率[11,13]。一些學(xué)者應(yīng)用低壓和灌注方法提高了組織工程骨的合成效率[14-16]。傳統(tǒng)方法是將細胞種植入多孔材料后再培養(yǎng)2周,而我們是利用低壓方法將細胞種植入多孔生物材料后,縮短組織工程骨的培養(yǎng)時間。由于生物材料多孔β-磷酸三鈣(β-TCP)植入體內(nèi)后,具有能夠逐漸被吸收,逐漸被人體自身骨生長替換的特點[17-18],所以,我們采用β-TCP和BMSCs結(jié)合合成組織工程骨。本研究將這種方法合成的組織工程骨用于靈長類動物脊柱后外側(cè)融合手術(shù),評估組織工程骨能否增強脊柱融合強度,能否作為手術(shù)中自體骨的替換物。

1 材料和方法

1.1 多孔生物材料 β-TCP,日本 Olympus公司提供。該材料多孔率為75%,孔徑200～400 μ m,孔與孔之間的連接通道直徑 100～200 μ m[10]。

1.2 BMSCs的分離和培養(yǎng) BMSCs采自于3～4歲雄性食蟹猴,體重3.3～4.9 kg。全身麻醉下,使用20 ml注射器和16號骨髓穿刺針,于食蟹猴股骨大轉(zhuǎn)子處抽取骨髓,DMEM(Dubberco's Minimal Essential Medium)懸浮,1000 r/min離心5 min,標(biāo)準培養(yǎng)液混勻。標(biāo)準培養(yǎng)液構(gòu)成:DMEM、1%抗生素/抗真菌藥(10000 U/ml青霉素 、10000 μ g/ml鏈霉素 、25 μ g/ml兩性霉素 B溶入 0.85%鹽水,GIBCO,USA)、10%FBS(Fetal bovine serum,GIBCOBRL,Lot No.3295241S)。將細胞培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)溫箱內(nèi),3 h后更換培養(yǎng)液,移除漂浮細胞,附著于培養(yǎng)皿的細胞主要是BMSCs[19]。以后培養(yǎng)液每3 d更換1次,大約2周,細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)增殖滿意后,用0.25%trypsin-EDTA從培養(yǎng)皿內(nèi)分離獲取細胞,然后進行分盤二次培養(yǎng),大約7 d后培養(yǎng)細胞長滿培養(yǎng)皿。

1.3 組織工程骨的準備 細胞擴增完成后,將擴增培養(yǎng)液改為骨細胞分化培養(yǎng)液,骨細胞分化培養(yǎng)液由下列成分構(gòu)成:標(biāo)準培養(yǎng)液內(nèi)加入100 nmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)、10 mmol/L β-甘 油 磷 酸(Sigma-Aldrich Co.)和 0.25 mmol/L維生素C(Wako)[19]。分化培養(yǎng)4 d,分離細胞在4℃,1000 r/min離心5 min,計數(shù),獲取2×106/ml細胞懸濁液。將β-TCP浸入細胞懸濁液內(nèi),然后放入低壓系統(tǒng),100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)下處理1 min,37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 h[16,20-21]。部分β-TCP/BMSCs工程骨用于電子掃描顯微鏡觀察(Hitachi S-4500,Japan),證實多孔β-TCP內(nèi)附著大量 BMSCs(圖1)。細胞附著3 h后,β-TCP/BMSCs工程骨被移植到食蟹猴體內(nèi)。

圖 1 β-TCP/BMSCs復(fù)合物(Bar=30 μ m)

1.4 手術(shù)過程 6只食蟹猴,在L4-5節(jié)段后外側(cè)橫突間植入移植材料行脊柱融合手術(shù)[22]。手術(shù)在全麻下進行。麻醉成功后,食蟹猴俯臥位,手術(shù)區(qū)碘酒酒精消毒,通過術(shù)前X線確定L4-5位置。取后正中切口,沿棘突切開豎脊肌,顯露椎板和橫突,棘上韌帶和椎小關(guān)節(jié)保持完整。術(shù)者用球磨鉆將橫突上方皮質(zhì)去除,將移植材料放置于L4-5去皮質(zhì)化橫突間,縫合筋脈和皮膚。術(shù)后肌注頭孢替坦2 d預(yù)防感染。食蟹猴在籠內(nèi)不限制活動和飲食。

1.4.1 移植材料 本研究使用的移植材料有3組(n=4側(cè)):①β-TCP/BMSCs工程骨:將 BMSCs種植入30×10×5 mm β-TCP 材料;②自體骨:約同樣大小骨塊取自于髂后上嵴;③單純β-TCP材料:同樣30×10×5 mm大小。

1.4.2 手術(shù)分組情況 2只食蟹猴體內(nèi)一側(cè)移植β-TCP/BMSCs工程骨,另一側(cè)移植自體骨;另外2只食蟹猴一側(cè)為自體骨,另一側(cè)為單純β-TCP材料;最后2只猴子為β-TCP/BMSCs工程骨和單純β-TCP材料。

1.5 評估 術(shù)后12周通過靜脈注射戊巴比妥處死猴子。手術(shù)取出L3～S1脊柱標(biāo)本,清除周圍軟組織。采用融合節(jié)段手法觸壓、微CT、外周定量CT(Peripheral Quantitative Computed Tomography,pQCT)和組織學(xué)方法觀察脊柱融合情況。

1.5.1 手法觸壓 手法觸壓測試觀察椎體左右兩個矢狀面。術(shù)者雙手把持融合節(jié)段的遠近端掰壓標(biāo)本,移植材料區(qū)域沒有活動即為融合,有活動即為非融合。

1.5.2 微CT 標(biāo)本收獲后用于微CT掃描(SMX-130CT-SV,Shimadzu,Japan)。掃描參數(shù):34 μ A,46 kV,掃描厚度0.16 mm。評估隨機區(qū)域骨形成的存在和融合骨量。

1.5.3 pQCT 所有L4-5橫突節(jié)段標(biāo)本都采用pQCT掃描,掃描參數(shù):0.12×0.12×0.77 mm voxel。每個標(biāo)本取用3個掃描切片,計算新形成骨的骨礦物質(zhì)密度(BMD)并得出其平均值。同時測量體外未植入的β-TCP的BMD,用于與移植術(shù)后 12周的β-TCP/BMSCs工程骨和單純β-TCP的比較。

1.5.4 組織學(xué)分析 標(biāo)本用10%福爾馬林液固定,酒精脫水,脫鈣(Decalcifying Solution A,Wako,Osaka,Japan),石蠟包埋,HE染色,顯微鏡觀察(Olympus,AX-70,Japan)。

2 結(jié)果

動物的手術(shù)過程均順利,術(shù)后動物喂養(yǎng),動物的活動均無異常。

2.1 手法觸壓 在β-TCP/BMSCs工程骨組和自體骨組,4例標(biāo)本均有3例達到融合,未融合的工程骨和自體骨標(biāo)本來源于同一只猴腰椎兩側(cè);而單純β-TCP組無一例融合。β-TCP/BMSCs工程骨組和自體骨組相比較,融合效果沒有明顯不同。

2.2 微CT 在β-TCP/BMSCs工程骨組,術(shù)后12周顯示腰椎橫突部位大量的新骨形成,明顯多于自體骨組的骨形成量;自體骨組僅表現(xiàn)為原植入骨的同質(zhì)融合(圖2)。

圖2 移植術(shù)后12周的微CT圖像(Bar=6.250 mm)

2.3 pQCT β-TCP/BMSCs工程骨組骨形成的BMD平均值明顯高于手術(shù)前的β-TCP。單純β-TCP組術(shù)后BMD平均值比術(shù)前β-TCP的BMD降低(圖3),可能由于β-TCP被吸收。

2.4 組織學(xué)觀察 橫斷面切片組織學(xué)染色顯示所有β-TCP/BMSCs工程骨內(nèi)存在骨生長,并與腰椎橫突生長融合(封三彩圖2.1)。矢狀面切片顯示β-TCP/BMSCs工程骨完全出現(xiàn)新生骨,沒有纖維組織形成(封三彩圖2.2);在單純β-TCP組,材料碎裂且沒有形成融合,取出的部分β-TCP材料組織圖像內(nèi)沒有骨性形成(封三彩圖2.3)。材料移植部位未見任何炎癥細胞存在。

3 討論

在食蟹猴脊柱后外側(cè)融合手術(shù),我們嘗試應(yīng)用了多孔人工骨β-TCP材料,在種植有BMSCs的多孔β-TCP組織工程骨內(nèi)能夠觀察到大量的新生骨,而單純β-TCP材料內(nèi)卻觀察不到骨形成。這些結(jié)果顯示對于多孔人工骨β-TCP的應(yīng)用,BMSCs是重要的。TCP材料在體內(nèi)的降解可以為骨形成提供Ca和P[18,23-24]。在移植手術(shù)前,由BMSCs分化得到成骨樣細胞,通過細胞在多孔材料內(nèi)的種植,大量成骨細胞附著于β-TCP內(nèi),這為移植術(shù)后多孔材料內(nèi)廣泛均勻成骨提供了基本保證。本研究使用的β-TCP內(nèi)具有和松質(zhì)骨類似的較大孔隙和連接通道,這也有益于多孔材料內(nèi)細胞的種植和術(shù)后組織血管的長入。多孔材料內(nèi)血運的建立,可以為人工骨內(nèi)骨形成提供一個較好的營養(yǎng)環(huán)境。β-TCP/BMSCs工程骨能夠在多孔材料內(nèi)誘導(dǎo)早期骨形成,新形成的骨覆蓋在 TCP材料內(nèi)孔的表面,并且限制TCP材料和組織液的接觸,這將導(dǎo)致β-TCP材料吸收的減慢[25]。

一些研究者在他們的研究里進一步改進骨細胞的

a:pQCT圖像;b:骨密度均值。

圖3 移植術(shù)后12周的pQCT結(jié)果培養(yǎng)技術(shù)[11,26-27]。然而,對于較大尺寸的人工骨材料,不是很容易將細胞種植入材料的中心部位;人工骨移植入體內(nèi)以后,多孔材料內(nèi)的BMSCs還需要與周圍組織液和血液進行物質(zhì)交換;然而,體外培養(yǎng)過程中,多孔材料內(nèi)的BMSCs并不能得到足夠的氧和其他營養(yǎng)物質(zhì)的支持。為了避開這一問題,我們把細胞種植進入多孔材料后,很快就將β-TCP/BMSCs工程骨移植入動物體內(nèi)。

在脊柱后外側(cè)融合手術(shù),在脊柱兩側(cè)應(yīng)該植入相同移植物材料來融合固定脊柱。然而在本研究中,我們在脊柱同一節(jié)段兩側(cè)植入了不同的移植材料,目的在于相同條件下比較不同移植材料的融合固定效果。這種研究方法證明,脊柱融合手術(shù)中,β-TCP/BMSCs工程骨能夠替換自體骨。

本研究顯示在移植手術(shù)12周后,β-TCP/BMSCs工程骨內(nèi)存在很好的骨形成。對于本研究的較好成骨結(jié)果,去皮質(zhì)化橫突與β-TCP/BMSCs工程骨的直接接觸可能是導(dǎo)致β-TCP內(nèi)骨生長的一個原因;分化后BMSCs的骨生成作用更為重要;另外,移植人工骨處存在的生物力學(xué)因素可能是保持骨代謝的又一個因素[28]。

在工程組織骨應(yīng)用在臨床之前,需要解決以下幾個問題:①培養(yǎng)細胞使用的胎牛血清(FBS)不符合醫(yī)學(xué)倫理,應(yīng)該用自體血清替換目前的FBS;②即使β-TCP是一個很好的材料,由于其不夠強硬的生物力學(xué)特點,它也不是最理想的人工骨。移植脆弱的人工骨將會導(dǎo)致假關(guān)節(jié)形成,然而,本研究所采用的β-TCP/BMSCs工程骨多數(shù)標(biāo)本全部形成新骨。在移植有多孔人工骨的手術(shù)后,必須采取必要的術(shù)后指導(dǎo)以防止移植物斷裂和假關(guān)節(jié)形成等危險發(fā)生。然而,這個應(yīng)用組織工程骨的脊柱融合手術(shù),并未采用釘棒系統(tǒng)固定脊柱。如果將工程組織骨和釘棒系統(tǒng)共同用于手術(shù),應(yīng)該可以得到確實的脊柱融合固定。

本研究成功地建立組織工程骨脊柱融合手術(shù)動物模型。我們推斷在臨床脊柱融合手術(shù)中,可以用多孔組織工程骨來建立確實的脊柱融合固定,多孔組織工程骨可以用于替換自體骨。

致謝:感謝Olympus公司無償提供β-TCP人工骨。

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