楊春寶 潘家祜*

1 江西省九江市中國(guó)人民解放軍第171醫(yī)院藥劑科（332000）

2 上海市復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理室（200032）

Prousion是一類產(chǎn)自日本的多孔狀礦粉，經(jīng)日本健康促進(jìn)協(xié)會(huì)橋本政和博士研究發(fā)現(xiàn)具有一定的生物學(xué)作用。由橋本政和提供的Prousion-A、B、C (P-A、P-B、P-C)是經(jīng)3種不同方法處理的這類礦粉。本研究分別采用化學(xué)和物理方法對(duì)其體外清除羥基自由基和超氧自由基的作用進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 Prousion對(duì)羥基自由基（OH·）作用的測(cè)定

1.1.1 用脫氧核糖法檢測(cè)Prousion對(duì)羥基自由基的影響[1,2]

Prousion（Prousion由日本橋本政和博士提供）：用0.2 %羧甲基纖維素鈉（CMC）配成不同濃度的混懸液：0.014、0.007、0.0035、0.00175g/mL。D-脫氧核糖（2'-Deoxy-D-Ribose），AMRESO.Co.Lot:0657；其余試劑均為分析純?cè)噭?。其測(cè)定原理為：Fe3+- EDTA與抗壞血酸及H2O2產(chǎn)生·OH，使脫氧核糖降解，在酸性環(huán)境中，降解產(chǎn)物可與TBA 反應(yīng)，形成粉紅色物質(zhì)，在 532nm 處進(jìn)行比色測(cè)定。

1.1.2 用電子自旋共振（Electron Spin Resonance，ESR）直接測(cè)定Prousion 對(duì)·OH的清除作用[3]

ESR測(cè)定儀：ER 200D-SRC，Bruker company.SF = 9.81GHz，SP =20mW，MF = 100kHz，MA = 0.8G； 自旋捕集劑為DMPO，由復(fù)旦大學(xué)測(cè)試中心測(cè)定。

表1 Prousion對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用 (±s，n = 4)

表1 Prousion對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用 (±s，n = 4)

濃度mol/L 甘露醇 OD 抑制率% 濃度g/L P-A OD 抑制率% P-B OD inhibition% P-C OD 抑制率%CMC 0.475±0.007 0 0 0.42±0.022 0 0.561±0.020 0 0.543±0.006 0 0.1953 0.424±0.001 10.74 0.0547 0.335±0.004 20.24 0.471±0.011 16.04 0.421±0.008 22.47 0.3906 0.402±0.019 15.37 0.1094 0.3043±0.007 27.55 0.456±0.005 18.72 0.394±0.009 27.44 0.7813 0.348±0.011 26.74 0.2188 0.233±0.0006 44.64 0.406±0.019 27.54 0.312±0.028 42.54 1.5625 0.296±0.008 37.68 0.4375 0.184±0.003 56.19 0.314±0.008 43.98 0.228±0.016 58.01 IC50 1.172 IC50 0.2209 0.2962 0.2183

表2 ESR檢測(cè) Prousion 清除羥基自由基的作用

表3 Prousion對(duì)超氧自由基的清除作用 (±s，n = 4)

表3 Prousion對(duì)超氧自由基的清除作用 (±s，n = 4)

（g/L） P-A OD 抑制率% P-B OD 抑制率% P-C OD 抑制率%CMC 0.38±0.002 0 0.375±0.009 0 0.432±0.022 0 0.05645 0.38±0.003 0 0.363±0.005 3.2 0.424±0.005 1.85 0.1129 0.349±0.005 8.2 0.355±0.006 5.33 0.392±0.004 9.26 0.2258 0.29±0.010 23.68 0.329±0.010 12.27 0.345±0.004 20.14 0.4516 0.248±0.006 34.74 0.179±0.017 52.27 0.213±0.003 50.69 IC50 0.4025 0.3854 0.3626

1.2 Prousion對(duì)超氧自由基（O2·）作用的測(cè)定

1.2.1 用黃嘌呤氧化酶法[4]檢測(cè)Prousion對(duì)超氧自由基的影響

黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase），Sigma，Lot: 9904；次黃嘌呤 Hypoxanthine，Sigma，Lot:9712；其余試劑均為分析純?cè)噭?。其測(cè)定原理為：次黃嘌呤通過黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O-2·)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑-對(duì)氨基苯磺酸與萘乙二胺的作用下生成紅色重氮化物，在550nm進(jìn)行比色測(cè)定。

1.2.2 用電子自旋共振（Electron Spin Resonance，ESR）直接測(cè)定Prousion 對(duì)O2·的清除作用

ESR測(cè)定儀：ER 200D-SRC，Bruker company.SF = 9.81GHz，SP =20mW，MF = 100kHz，MA = 0.8G；由復(fù)旦大學(xué)測(cè)試中心測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 Prousion對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

2.1.1 脫氧核糖法測(cè)定Prousion清除羥基自由基的作用，見表1。

上述結(jié)果表明，Prousion-A、B、C對(duì)羥基自由基（·OH）的IC50分別為0.2209、0.2962和0.2183 g/L，其作用強(qiáng)弱順序?yàn)镻-C＞P-A＞P-B。

2.1.2 ESR的測(cè)定結(jié)果，見表2和圖1。

經(jīng)ESR測(cè)定Prousion對(duì)羥基自由基（OH·）的清除作用的強(qiáng)弱順序?yàn)镻-C＞P-B～P-A。本結(jié)果佐證了上述脫氧核糖法的測(cè)定結(jié)果。

2.2 Prousion對(duì)超氧自由基（O2·）的清除作用

2.2.1 黃嘌呤氧化酶法測(cè)定Prousion清除超氧自由基的作用，見表3。

圖1 ESR檢測(cè) Prousion 清除.羥基自由基作用的圖譜

圖2 ESR檢測(cè) Prousion 清除.羥基自由基作用的圖譜

表4 ESR檢測(cè) Prousion 清除超氧自由基的作用.

上述結(jié)果表明，Prousion-A、B、C對(duì)超氧自由基（O2·）的IC50分別為0.4025、0.3854和0.3626g/L，其作用強(qiáng)弱順序?yàn)镻-C＞P-B＞P-A。

2.2.2 ESR的測(cè)定結(jié)果，見表4和圖2。

經(jīng)ESR測(cè)定，Prousion對(duì)超氧自由基（O2·）的清除作用強(qiáng)弱順序?yàn)镻-C＞P-B＞P-A。本結(jié)果也證實(shí)了上述黃嘌呤氧化酶法的測(cè)定結(jié)果。

3 討 論

為了解Prousion原料的理化性質(zhì)，我們?cè)趶?fù)旦大學(xué)國(guó)家微分析中心采用XL30FEG掃描電鏡和能譜分析儀對(duì)Prousion原料進(jìn)行了觀察與分析。結(jié)果表明：Prousion原料粉末有較好的細(xì)度，粒徑≤5μm。所含的大多為常量元素，如C、O、Na、Al、Si、K、Ca、Fe等，其中含有一些多孔的微粉。

我們機(jī)體在代謝過程中因多種原因產(chǎn)生的氧自由基劇增會(huì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。這種氧化應(yīng)激損傷以超氧陰離子自由基和羥基自由基為甚。它們也是腫瘤、心血管疾病等許多疾病以及衰老的重要原因。這類氧自由基的檢測(cè)有多種方法[5-8]。

為探討Prousion對(duì)氧自由基的清除作用，本研究分別采用化學(xué)和物理方法對(duì)危害較大的超氧自由基和羥基自由基進(jìn)行檢測(cè)，即分別采用黃嘌呤氧化酶法和D-脫氧核糖法檢測(cè)Prousion對(duì)這兩個(gè)氧自由基的清除作用，采用電子自旋共振（ESR）測(cè)定儀進(jìn)行驗(yàn)證。檢測(cè)結(jié)果不僅證明了Prousion對(duì)這兩種氧自由基的清除作用，而且，通過化學(xué)測(cè)定，獲得了Prousion清除作用IC50的重要參數(shù)，ESR測(cè)定又為這些重要參數(shù)提供了較為一致的佐證。

[1]Laughton MJ,Halliwell B,Evans PJ,et al.Antioxidantand pro-oxidant actions of the plant phenolics quercetin,gossypol and myricetin[J].Biochem Pharmacol,1989,38 (17): 2859-2865.

[2]Ko FN,Liao CH,Hsiung Y,et al.Antioxidant properties of demethyldiisoeugenol[J].Biochimicaet Biophysica Acta,1995,1258(2):145-152.

[3]Schweikert C,Liszkay A,Schopfer P.Polysaccharide degradation by Fenton reaction or peroxidase generated hydroxyl radicals in isolated plant cell walls[J].Phytochemistry,2002,61(1): 31–35.

[4]Oyanagui Y.Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity[J].Analytical Biochemistry,1984,142(2): 290-300.

[5]Togashi H,Shinzawa H,Matsuo T,et al.Analysis of hepatic oxidative stress status by electron spin resonance spectroscopy and imaging[J].Free Radical Biol Med,2000,28(6): 846-853.

[6]Sachdev S,Davies KJA.Production,detection,and adaptive responses to free radicals in exercise[J].Free Radical Biol Med,2008,44(2):215-223.

[7]楊芬,張瑞萍,賀玖明,再帕爾·阿不力孜.羥自由基的產(chǎn)生、捕集及檢測(cè)方法[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,42(7): 692-697.

[8]鄭晶泉.抗氧化劑抗氧化方法研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2000,27(1):37-40.