張東亮 王 薇 吳巧鳳*

浙江中醫(yī)藥大學藥學院（310053）

雞腿菇，學名毛頭鬼傘（Copyinds Comatus），又名刺蘑菇、雞腿蘑，因形如雞腿，營養(yǎng)豐富，肉質肉味如雞絲而得名。目前它已被定為符合聯(lián)合國糧農組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）要求的集“天然、營養(yǎng)、保健”3種功能為一體的16種珍稀食（藥）用真菌之一[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，雞腿菇有效活性成分多糖具有降血糖、調血脂、抑菌、抗氧化，提高免疫力、抗腫瘤等多種生理活性作用[2-5]，因此對雞腿菇資源的開發(fā)具有重要意義。目前雞腿菇多糖多采用熱水浸提[6]，超聲波[7]或微波輔助提取[2]等方法，但仍以工藝簡單，多糖提取率較高的統(tǒng)熱水浸提的方法為主[3,6,8]。本試驗旨在利用響應面分析法[9-11]，優(yōu)化雞腿菇多糖的熱水浸提工藝。

1 儀器和試藥

儀器：S22PC可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）；R-201旋轉蒸發(fā)器（上海申勝生物科技有限公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪于華儀器廠）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪于華儀器廠）。

試藥：雞腿菇干品產自浙江省麗水市，經浙江中醫(yī)藥大學藥學院資源教研室俞冰副教授鑒定為Copyinds Comatus。葡萄糖標準品由中國藥品生物制品檢定所提供（批號110833-200503），其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 雞腿菇多糖的含量測定[12,13]

2.1.1 標準品溶液和供試品溶液的配制

標準品溶液：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品1.0010g，入100mL容量瓶中并加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻得葡萄糖標準品儲備液。從中移取1mL溶液加蒸餾水稀釋，定容于100mL容量瓶中得濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標準品溶液。

供試品溶液：分別準確稱取雞腿菇干品15份，每份5.0g，加20倍量80%乙醇于80℃水浴加熱回流，趁熱抽濾，反復3次，每次2h，殘渣以熱水浸提得雞腿菇多糖溶液（具體操作步驟見表1和表2中的因素和水平），趁熱抽濾，反復3次，合并濾液，濃縮后定容于100mL容量瓶，即得供試品溶液。

2.1.2 線性關系的考察

精密吸取葡萄糖標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于25mL比色管中，各加蒸餾水補至1mL，再各加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，渦旋混勻后，冷卻30min至室溫后，以蒸餾水為空白對照，在490nm波長處于分光光度計上分別測定吸光度，得吸光度Y與濃度X的回歸方程：Y=6.8271X＋0.0695，相關系數(shù)R=0.9994，表明葡萄糖在0～0.1mg/mL濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3 精密度試驗

取葡萄糖標準品溶液 1mL，置于 25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項下方法進行。平行測定6次吸光度，結果RSD為0.93%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液1mL，定容于25mL容量瓶中，移取1mL溶液置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項下方法進行。分別于10、20、30、40、50、60min后測定吸光度，結果RSD為0.86%，表明在1h內吸光度穩(wěn)定，故多糖含量測定應在顯色后應在1h內完成測定。

2.1.5 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品溶液9份，分別加入3個水平的葡萄糖標準品溶液，定容于25mL容量瓶中，從中移取1mL入25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項下方法進行，測定吸光度，計算加樣回收率，9次加樣回收率平均值為99.0%，RSD為2.94%，表明本測定方法可靠。

2.1.6 多糖的含量測定

分別移取供試品溶液各1.0mL，蒸餾水定容于25mL容量瓶，搖勻后各取1mL，置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項中方法進行，并在490nm波長處于分光光度計上測定吸光度，由回歸方程計算多糖含量。結果見表2。

2.2 雞腿菇多糖的提取工藝研究

2.2.1 響應面分析法因素的選取及方案分析

分別準確稱取雞腿菇干品5.0g，按“2.1.2”項下方法預處理得殘渣，后根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，綜合相關單因素實驗數(shù)據，選取提取溫度、料液比、提取時間3個因素，采用SAS（SAS Package Veion 9.1.3）對數(shù)據進行回歸分析。以雞腿菇多糖提取率作為響應值（Y）。方案及試驗結果見表1和表2。

表1 響應面試驗因素考察表

2.2.2 試驗結果分析

采用SAS 9.1.3軟件對表2的結果進行響應面回歸分析，得擬合方程：Y=3.097442 + 0.244976X1- 0.070011X2+0.217385X3- 0.176271X1×X1+0.14432X1×X2- 0.030004X1×X3- 0.202157X2×X2+ 0.003289X2×X3-0.12838X3×X3，對回歸方程進行顯著性檢驗和方差分析，結果見表3。

表2 響應面試驗安排及結果

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析結果

由表3可知，在置信區(qū)間95%時，線性相關系數(shù)為98.65%.可見回歸方程具有較高的顯著性，可用于替代試驗點對實驗結果進行分析，并進一步對回歸方程各項進行顯著性檢驗，見表4。

表4 回歸方程各項的顯著性檢驗結果

由表4可知，方程一次項、二次項、交互項對提取率影響都具有顯著性差異。由此可見，各具體實驗因素對響應面值的影響非簡單的線性關系。同時做出等值線圖和響應面圖（圖1～6），進行分析計算后得出理論最佳提取工藝條件為：提取溫度：76.69℃，料液比：1∶20.19，提取時間：108.15min，在此條件下雞腿菇多糖的理論提取率為26.03mg/g。結合實際生產條件和方差分析結果，確定最佳提取工藝為：加雞腿菇藥材20倍量的水，在77℃溫度提取108min。

2.2.3 驗證性試驗

圖1 y= f1(x1，x2)的等值線（x 3=0）

圖2 y=f1(x1，x2)響應面值(x3=0)

圖3 y=f2(x2，x3)等值線圖(x1=0)

圖4 y=f2(x2，x3)響應面圖（x1=0）

圖5 y=f3(x1，x3)等值線(x2=0)

圖6 y=f3(x1，x3)響應面圖(x2=0)

按照最佳熱水浸提工藝進行驗證性試驗，提取3次，測得靈芝多糖的平均提取率為25.69mg/g，RSD為0.65%。表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結 論

3.1 響應面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化反應條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業(yè)等方面[14]。它與正交試驗設計法不同，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點，并能夠通過相應圖尋求在整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應值的最優(yōu)值。

3.2 根據響應面分析確定雞腿菇多糖的最佳提取工藝參數(shù)：浸提溫度 77℃，料水比 1∶20，浸提時間108min。按照此工藝條件提取雞腿菇多糖的提取率較高，可達 25.69mg/g，試驗值比理論預測值基本吻合，說明建立的數(shù)學模型能較好的預測各因素同提取率之間的關系。

3.3 12號試驗表明在浸提溫度 80℃，料水比 1∶20，浸提時間120min條件下，提取率為26.48mg/g，比最佳工藝提取率稍高。但其提取過程中耗能大，且提取時間比最佳工藝長，不適合工業(yè)化大生產的需要。因此最終確定雞腿菇多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：浸提溫度77℃，料水比 1∶20，浸提時間108min，多糖提取率為25.69mg/g。

3.4 雞腿菇作為真菌中的“后起之秀”，因其較高的營養(yǎng)和藥用價值而越來越受到重視。由本文研究及文獻報道可知雞腿菇含有較高的多糖，本文根據生產實際，確定了雞腿菇多糖的熱水浸提的最佳工藝，可為雞腿菇多糖的進一步開發(fā)提供科學的實驗依據。

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