曲明陽* 鄭永勝 邢光明 趙 莉 李方華 馮秉安

1 大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普通外科（116027）

2 大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科（116027）

3 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（116011）

右旋檸烯（D-limonene）是從中藥橘皮中提取有效單體成分，已經(jīng)被證明對多種腫瘤具有明顯的抑制作用。Fascin-1是一種重要的胞質(zhì)蛋白，決定著細胞微絲骨架的分布和活動，可能在細胞遷移、侵襲以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用[1]。本實驗將探討中藥提純單體右旋檸烯對乳腺癌細胞微絲骨架結構的影響及其Fascin-1蛋白相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

右旋檸烯購自美國Sigma公司，純度97%；Matrigel購自美國Collaborative Research公司；纖維粘連蛋白購自北京大學醫(yī)學部細胞室；RPMI-1640培養(yǎng)液及MTT為Gibco BRL公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為購自美國Sigma公司；小牛血清購自中國聯(lián)星生物大連公司；Fascin-1單抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品；Transwell小室為美國BD公司產(chǎn)品其上Polycarbonate濾膜孔徑為8μm；酶標儀及顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人乳癌高轉(zhuǎn)移細胞株MDA-MB-435購自中科院上海細胞所，以含10%小牛血清的RPMI-1640常規(guī)培養(yǎng)，以處于對數(shù)生長期的細胞備用。

1.2.2 共聚焦顯微鏡下乳腺癌細胞微絲骨架結構

預先置無菌蓋玻片于6孔板中，每孔接種104個人乳腺癌細胞MDAMB-435，待24h后確認細胞已經(jīng)爬片生長，加入不同濃度右旋檸烯常規(guī)培養(yǎng)24h，經(jīng)PBS液漂洗，4%甲醛固定25min后，用含有0.2%Tritonx-100和0.1%BSA的PBS溶液室溫下封閉滲透30min，然后在避光狀態(tài)下將預先配置好的5μg/mL的Phalloidin-FIFC在37℃下孵育1h，對照組用PBS代替。PBS液充分漂洗，PI復染30min，PBS液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架形態(tài)改變。

1.2.3 細胞侵襲實驗

在Transwell小室Polycarbonate濾膜上下面分別涂纖維粘連蛋白和 matrigel，風干備用。取不同處理組的MDA-MB-435細胞100μL（2.0×104個）于Transwell小室，37℃溫育24h。70%乙醇固定，擦去濾膜內(nèi)表面細胞，HE染色，以中性樹脂封片。在200倍光學顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)每個視野細胞數(shù)目，取其平均值。以侵襲細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.2.4 Western Blot分析

不同濃度右旋檸烯處理的乳腺癌細胞，更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集上清，離心，冷凍干燥。變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，小牛血清封閉后，分別加入1∶400稀釋的一抗，4℃過夜，加二抗及顯色劑，檢測雜交蛋白，計算條帶的積分吸光度（IA）：IA=平均吸光度×面積。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 激光共聚焦細胞微絲骨架結構圖像

右旋檸烯作用后，以F-actin為基礎的微絲骨架結構發(fā)生明顯變化，質(zhì)膜突起和膜皺褶減少，細胞間排列較為規(guī)則，細胞基底外側微刺結構明顯減少（圖1）。

圖1

2.2 右旋檸烯對乳癌細胞侵襲能力的影響

以0.25、0.125、0.0625mmol/L濃度的右旋檸烯預處理乳癌細胞24h后，收集細胞制成懸液進行對重組基底膜的侵襲實驗。結果表明，在無毒劑量下，右旋檸烯對乳癌細胞24h侵襲能力具有明顯的抑制作用（61.7±8.4、89.3±11.0和105.3±7.7），與對照組（166.1±12.2）比較差異顯著（P＜0.05），見表1和圖2。

表1 右旋檸烯對乳癌細胞侵襲能力的影響（n=3）

圖2

2.3 右旋檸烯對乳腺癌細胞Fascin-1蛋白表達的影響

以0.25、0.125、0.0625 mmol/L不同濃度藥物預處理24h后，收集乳腺癌細胞進行Western Blot蛋白免疫印記染色并計算積分光密度。結果顯示，相對分子質(zhì)量為56×103的Fascin-1蛋白表達受到抑制，以高濃度即0.25mmol/L最為明顯，各組積分光密度分別為（2.9±0.3）、（12.4±0.7）及（19.3±0.7），與對照組（28.6±0.5）比較差異顯著（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同濃度右旋檸烯作用下，相對分子質(zhì)量為56×103的Fascin-1表達下調(diào)

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是其重要致死原因。因此，發(fā)現(xiàn)針對性的治療靶點以及低毒有效的抗轉(zhuǎn)移藥物具有重要的意義。細胞微絲骨架重排和其介導的細胞運動、細胞間作用是腫瘤轉(zhuǎn)移領域研究熱點之一。F-actin是微絲骨架的主要結構蛋白，其在不同表型腫瘤細胞中分布及表達不同，參與多種腫瘤惡性化轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)移過程[2]。但F-actin廣泛存在于正常細胞和腫瘤細胞中，無組織表達特異性，缺乏臨床應用價值。

Fascin-1是一種重要的胞質(zhì)蛋白，具有與F-actin結合的作用，并決定F-actin微絲骨架的分布和活動[3]。而且，在其他多種以actin為基礎的細胞運動相關結構均作為關鍵結合蛋白出現(xiàn)，發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。Fascin-1定位于細胞質(zhì)張力纖維和細胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足、微棘中。細胞的絲狀偽足和微棘與細胞的運動、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有密切關系，提示Fascin-1蛋白可能在細胞遷移、侵襲以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用[2]。對上皮細胞的研究發(fā)現(xiàn)，當Fascin-1與F-actin結合，細胞伸出偽足和微棘，在細胞外基質(zhì)（ECM）上的遷移能力提高。更為重要的發(fā)現(xiàn)是，F(xiàn)ascin-1在多種正常組織器官的上皮中不表達或者低表達，而在該部位發(fā)生的惡性腫瘤中表達水平卻不同程度的提高，因此，F(xiàn)ascin-1在抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究中具有重要的實用價值[4,5]。

右旋檸烯是從中藥橘皮中提取的有效單體成份，具有廣譜的抗癌活性。我們的實驗結果表明，右旋檸烯作用后，乳腺癌細胞以F-actin為基礎的微絲骨架結構發(fā)生明顯變化，質(zhì)膜突起和膜皺褶減少，細胞間排列較為規(guī)則，細胞基底外側微刺結構明顯減少。而進一步的體外侵襲實驗表明，右旋檸烯可以有效的抑制乳腺癌細胞的侵襲能力，侵襲基底膜細胞數(shù)顯著減少。提示右旋檸烯可以通過改變細胞骨架結構來調(diào)控細胞運動，進而影響其侵襲行為。通過蛋白印跡實驗，我們發(fā)現(xiàn)，伴隨著細胞運動能力和侵襲能力的減弱，F(xiàn)ascin-1蛋白表達顯著下降，說明右旋檸烯是通過抑制該蛋白的表達，參與了乳腺癌細胞體外侵襲的調(diào)控。

[1]Sun J. D-Limonene: safety and clinical applications[J]. Altern Med Rev,2007,12(3):259-264.

[2]Hashimoto Y. Roles of Fascin in human carcinoma motility and signaling: prospects for a novel biomarker?[J]. Int J Biochem Cell Biol,2005,37(9):1787-1804.

[3]Kureishy N,Sapountzi V,Prag A,et al. Fascins and their roles in cell structure and function [J].BioEssays,2002,24(4):350-361.

[4]Karasavvidou F,Barbanis S,Pappa D,et al. Fascin determination in urothelial carcinomas of the urinary bladder: a marker of invasiveness[J]. Arch Pathol Lab Med,2008,132(12):1912-1915.

[5]Kostopoulou E,Angelidou S,Daponte A.Fascin can be an auxiliary immunomarker of ovarian granulosa cell tumors: comparison with calretinin and inhibin-alpha[J].Eur J Gynaecol Oncol,2008,29(6):638-642.