張 偉,索占偉,劉鐘杰,穆 祥,范 開

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;2.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京昌平102206)

志賀樣毒素Ⅱ型變異體[1](SLT-Ⅱe)是豬水腫病大腸桿菌導(dǎo)致仔豬形成水腫病的主要致病因子。研究證明,SLT-Ⅱe能損傷小腸上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞[2],引起細胞分泌功能障礙,進而導(dǎo)致微血管舒縮和通透性發(fā)生變化,最終形成豬水腫病。本試驗通過研究SLT-Ⅱe作用大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞(MVECs)后,其培養(yǎng)上清液中 IL-8、IL-6和PGI2的濃度變化,以期從SLT-Ⅱe影響微血管內(nèi)皮細胞分泌功能方面,探討SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜MVECs的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(GIBICO公司,U.S.A批號:1348411),D-Hank′s干粉(Sigma公司),胎牛血清(奧地利 PAA Laboratories GmbH 批號:A04105-0180),氧化苦參堿(購自中國藥品生物制品檢定所),SLT-Ⅱe粗制品(蛋白含量為10 mg/mL)由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供。鑒定試劑:兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清、羊抗兔IgG-FITC,均購自Sigma公司。550型酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司生產(chǎn))。

1.2 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng) 選用出生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠,參照索占偉[3]等的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法,進行微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)、純化和傳代培養(yǎng)。用免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞vWF因子相關(guān)抗原的方法對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。

1.3 試驗細胞準(zhǔn)備及處理 試驗選用經(jīng)過鑒定的第5代大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞。將呈80%融合狀態(tài)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞以0.25%胰蛋白酶消化,細胞懸液接種到48孔細胞培養(yǎng)板,接種密度為 5×105/mL,每孔 250 μ L,置 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合成單層細胞時開始試驗。

1.4 試驗分組及指標(biāo)測定 將培養(yǎng)的融合成單層細胞狀態(tài)的大鼠腸黏膜MECs分為對照組和毒素組。每組設(shè)重復(fù)孔3個(其中PGI2測量組設(shè)5個重復(fù)孔),對照組加含5%血清的維持培養(yǎng)基,毒素組加含15.0 μ g/mL的SLT-Ⅱe的維持培養(yǎng)基,分別培養(yǎng) 3、6、9、12 h 后 ,收集細胞培養(yǎng)上清液,貯存于-20℃冰箱內(nèi)待測。

1.5 細胞上清液中IL-8、IL-6和PGI2濃度測定

IL-8、IL-6和PGI2的濃度測定按照尚柏公司和USCN LIFE公司提供的 ELISA試劑盒的操作步驟進行。

2 結(jié)果

2.1 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜MVECs不同時間點分泌IL-8的影響 結(jié)果見表1。

表1 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的影響 pg/mL,n=3)

表1 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的影響 pg/mL,n=3)

與對照組比較,*:P＜0.05;**:P＜0.01;組內(nèi)前后兩個時間點相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

?

由表1可以看出,對照組大鼠腸黏膜MVECs在第3、6小時和12小時均有IL-8分泌,且在第6、9小時和12小時的分泌量與第3小時相比,差異極顯著(P＜0.01),說明IL-8是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細胞因子之一,其分泌量隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞增殖引發(fā)細胞數(shù)量上升而增加。

毒素組大鼠腸黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第3、6、9小時和12小時,IL-8的分泌量均較相應(yīng)時間點對照組有顯著升高,說明SLT-Ⅱe有刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的作用。另外,SLT-Ⅱe組4個時間點的IL-8的分泌量相比,后一時間點IL-8的分泌量均顯著高于前一時間點,說明在12 h內(nèi),SLT-Ⅱe具有持續(xù)刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-8的作用。

2.2 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-6的影響 結(jié)果見表2。

表2 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜 MVECs分泌IL-6的影響 pg/mL,n=3)

表2 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜 MVECs分泌IL-6的影響 pg/mL,n=3)

與對照組比較,*:P＜0.05;**:P＜0.01;組內(nèi)前后兩個時間點相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

?

由表2可以看出,對照組大鼠腸黏膜MVECs在第3、6、9小時和 12小時均有 IL-6分泌,且相鄰兩個時間點的分泌量相比,后者顯著高于前者,說明IL-6是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細胞因子之一,其分泌量隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞增殖引發(fā)細胞數(shù)量上升而增加。

毒素組大鼠腸黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第3、6、9小時和12小時,IL-6的分泌量均較相應(yīng)時間點對照組有顯著升高,說明SLT-Ⅱe有刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-6的作用。

2.3 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜MVECs分泌PGI2的影響 結(jié)果見表3。

表3 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜 MVECs分泌PGI2的影響 pg/mL,n=5)

表3 SLT-Ⅱe對大鼠腸黏膜 MVECs分泌PGI2的影響 pg/mL,n=5)

與對照組比較,*:P＜0.05;**:P＜0.01;組內(nèi)前后兩個時間點相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

?

由表3可以看出,對照組大鼠腸黏膜MVECs在各時間點均有PGI2分泌,前后兩個時間點的PGI2分泌量相比,差異不顯著,說明PGI2是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細胞因子之一,其分泌量在12 h內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)。

毒素組大鼠腸黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第 3、6、9 h和12 h,PGI2分泌量均較對照組有顯著升高,說明 SLT-Ⅱe有刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌PGI2的作用。

3 討論

IL-8主要由單核細胞、吞噬細胞和內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生,參與趨化和激活嗜中性粒細胞、T細胞等炎性細胞,促進釋放生物活性物質(zhì),增強炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[4]。IL-6是1980年用Poly I-C刺激成纖維細胞產(chǎn)生的一種能抑制病毒復(fù)制的細胞因子,主要由T細胞、B細胞、單核細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生,具有刺激多種細胞增殖,促進細胞分化,加速肝細胞急性期蛋白的合成等作用,參與多種炎癥反應(yīng)過程。

本試驗研究證實,對照組大鼠腸黏膜MVECs在各時間點均有IL-6和IL-8分泌,證實大鼠腸黏膜MVECs是IL-6和IL-8分泌的細胞因子。有研究證實,IL-6和IL-8具有刺激細胞增殖作用[5]。從本試驗結(jié)果可以看出,對照組的IL-6和IL-8濃度均隨時間延長而上升,其中IL-6分泌量均顯著高于前時間點,第6、9小時和第12小時的IL-8分泌量顯著高于同組第6小時時,說明MVECs分泌的IL-6和 IL-8可能作用自身,引起MVECs增殖,最后引起分泌量上升。

大量研究資料證實,IL-6和IL-8與炎癥的發(fā)生具有一定的關(guān)系[6]。IL-8參與趨化和激活嗜中性粒細胞、T細胞等炎性細胞,IL-6能刺激巨噬細胞等炎性細胞分化,釋放生物活性物質(zhì),增強炎癥反應(yīng)。從本試驗結(jié)果可以看出,毒素組各時間點的IL-6和IL-8濃度均顯著高于對照組,說明SLT-Ⅱe能促刺激大鼠腸黏膜MVECs分泌IL-6和IL-8,有增強炎癥反應(yīng)作用。研究資料證實,在水腫形成過程中,主要原因可能是SLT-Ⅱe損傷微血管內(nèi)皮細胞,但是微血管損傷與形成水腫之間的確切作用機制尚未弄清。本試驗結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),SLT-Ⅱe能刺激大鼠腸黏膜MVECs顯著增加對IL-6和IL-8的分泌,說明SLT-Ⅱe損傷血管內(nèi)皮細胞,引起其對IL-6和IL-8的分泌增加,加重炎癥反應(yīng)進程,導(dǎo)致血管通透性發(fā)生改變,這可能就是SLT-Ⅱe引發(fā)豬水腫病的機制之一。

PGI2是強烈的血管平滑肌舒張劑,能擴張血管,抑制血小板聚集,在血栓形成和改變血管通透性方面具有重要作用。從本試驗結(jié)果可以看出,對照組大鼠腸黏膜MVECs在各時間點均有PGI2分泌,說明PGI2是大鼠腸黏膜MVECs分泌的細胞因子之一,其分泌量在12 h內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)。SLT-Ⅱe在引發(fā)水腫過程中,有血管通透性增加現(xiàn)象,但有關(guān)通透性形成的確切機制尚在研究中。從本試驗結(jié)果可以看出,毒素組各時間點PGI2分泌量均顯著高于對照組,說明SLT-Ⅱe具有刺激血管內(nèi)皮細胞分泌PGI2的作用,恰好說明SLT-Ⅱe能引起微血管舒張,微血管通透性上升,這可能就是SLT-Ⅱe的致病機理之一。

綜上所述,SLT-Ⅱe能刺激微血管內(nèi)皮細胞對IL-8和IL-6的分泌增加,刺激相應(yīng)炎性細胞增殖,促進釋放炎性物質(zhì),加重炎癥反應(yīng),改變微血管通透性,進而形成水腫,這可能是SLT-Ⅱe的致病機理之一;PGI2的分泌增加,其維持微血管正常舒縮的功能失調(diào),導(dǎo)致血管通透性發(fā)生改變,進而引起水腫,這可能是SLT-Ⅱe的另一致病機制。

[1]Kausche F M,Dean E A,A rp L H,et al.An experimental model for subclinical edema disease(Escherichia coli entertoxemia)manifest as vascular necrosis in pigs[J].Am J Vet Res,1992,53(3):281-287.

[2]Waddell T E,Coomber B L,Gy les C L.Localization of potential binding sites for the edema disease verotoxin(VT 2e)in pigs[J].Canadian Journal of Veterinary Research,1998,62(2):81-86.

[3]索占偉,穆祥,許劍琴,等.犬鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)[J].解剖學(xué)報,2005,36(2):214-217.

[4]鄒敏君,劉肖珩,李毅,等.IL-8誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移的實驗研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2006;23(5):1013-1016.

[5]Koch A E,Polverini P J,Kunkel S L,et al.Interleuk in-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis[J].Science,1992,258(5089):1798-1801.

[6]朱金水,朱勵,余小虎,等.氧化苦參堿對肝纖維患者IL-6、IL-8、IL-10水平影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2003,19(3):191-192.