張彥紅,樊惠英,蔡紹鑫,羅開(kāi)健,廖 明,任 濤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510642)

鵝副黏病毒病是由鵝副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。該病以腸道糠麩樣潰瘍,胰腺、脾臟腫脹且表面有大小不等的灰白色壞死灶為主要特征[1]。自1997年首次在國(guó)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)后[2],目前該病在山東、廣西、安徽、浙江、上海、遼寧、云南和江蘇等地區(qū)廣泛流行[3],嚴(yán)重影響了我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。本研究擬對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的鵝副黏病毒61/GO/GD/05分離株進(jìn)行生物學(xué)特性試驗(yàn),以期全面認(rèn)識(shí)、了解其特性,為禽副黏病毒的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株 鵝副黏病毒61/GO/GD/05株、NDV陽(yáng)性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 9～11日齡SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;粵黃雞苗購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場(chǎng);1日齡清遠(yuǎn)鵝購(gòu)自清遠(yuǎn)市博士鵝業(yè)有限公司。

1.3 試劑 T rizol LS Reagent購(gòu)自 Invitrogen公司;Reverse T ranscriptase XL(AMV)、RNA酶抑制劑(PRI)、dNTPs、DNA Marker DL-2 000、Ex Taq聚合酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.4 病毒的增殖與傳代 將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水稀釋1 000倍,尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚5枚,0.2 mL/枚,37℃孵育72 h,逐日觀(guān)察,期間棄去24 h以?xún)?nèi)死亡的雞胚,最終無(wú)菌收集尿囊液,作為第1代尿囊液毒。如此反復(fù)傳代至第3代,收集第3代尿囊液毒作為工作用種毒,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作連續(xù)10倍稀釋(10-6～10-10),每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種8枚10日齡的SPF雞胚,0.2 mL/枚,37℃孵育72 h,逐日觀(guān)察,期間棄去24 h以?xún)?nèi)死亡的雞胚,最終無(wú)菌采集尿囊液并測(cè)定其HA效價(jià),以HA效價(jià)為4log2以上判為陽(yáng)性。按照 Reed-Muench法計(jì)算 61/GO/GD/05分離株的EID50。

1.6 雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT)的測(cè)定 參照OIE試驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[4],將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作連續(xù)10倍稀釋(10-6～10-10),每個(gè)稀釋度接種5個(gè)雞胚,0.2 mL/枚,每天觀(guān)察4次,連續(xù)觀(guān)察7 d。記錄每個(gè)雞胚的死亡時(shí)間。

1.7 腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)的測(cè)定 參照OIE試驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[4],將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍稀釋后經(jīng)腦內(nèi)接種10只1日齡SPF雛雞,每只接種0.05 mL,另設(shè)10只注射生理鹽水,作為對(duì)照組,隔離飼養(yǎng)。接種后,每24 h觀(guān)察發(fā)病及死亡情況并打分,連續(xù)觀(guān)察8 d。

1.8 靜脈致病指數(shù)(IVPI)的測(cè)定 參照OIE試驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[4],將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍稀釋后,接種10只6周齡的SPF雞,每只靜脈接種0.1 mL,另設(shè)10只注射生理鹽水作為對(duì)照,隔離飼養(yǎng),每24 h觀(guān)察1次,連續(xù)觀(guān)察10 d。根據(jù)發(fā)病和死亡情況,通過(guò)對(duì)每只雞的記分(正常0分,患病1分,麻痹 2分,死亡 3分)計(jì)算IVPI。

1.9 對(duì)雛雞、雛鵝的致病性試驗(yàn) 將61/GO/GD/05株尿囊液作10倍稀釋后,通過(guò)腿部肌肉注射接種10只21日齡的非免疫雞和鵝,0.2 mL/只。同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組10只。攻毒后觀(guān)察15 d,記錄發(fā)病及死亡情況。

1.10 對(duì)鵝半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定 將61/GO/GD/05株尿囊液用滅菌生理鹽水作連續(xù)10倍稀釋(10-0～10-5),每個(gè)稀釋度分別經(jīng)腿部肌肉注射接種10只14日齡NDV陰性的健康鵝,0.5 mL/只。另取10只為生理鹽水對(duì)照組。攻毒后觀(guān)察15 d,記錄發(fā)病及死亡情況,采用Reed-Muench法計(jì)算出LD50。1.11 分子生物學(xué)特性

1.1 1.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank上的APMV基因組序列,使用 DNAStar(Verison5.07)和 Primer Premier(Version5.0)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增F基因的特異性引物,引物序列如下:P1:F-P1:5′-attat GGATCCATGGGCTCCAAACCTTCTACCAGGT TCC-3′(BamH Ⅰ ),F-P2:5′-attat GGATCC TCATGCTCCTGTAGTGGCTC-3′(BamH Ⅰ),預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度約為1 662 bp。

1.1 1.2 RNA提取及RT-PCR 用Trizol Reagent提取病毒RNA,將 RNA沉淀溶于15 μ L DEPC水中;然后參照 Reverse T ranscriptase XL(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,參照 Ex Taq聚合酶使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 PCR,PCR產(chǎn)物參照快速純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收。

1.1 1.3 序列測(cè)定及遺傳變異分析 對(duì)回收后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。應(yīng)用DNAStar 5.07軟件拼接測(cè)序后的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。將GPMV 61/GO/GD/05分離株與國(guó)內(nèi)外13株APMV-1參考株的F基因進(jìn)行序列相似性分析,并按照Lmniczi等[5]建立的方法對(duì)61/GO/GD/05分離株進(jìn)行基因分型。

2 結(jié)果

2.1 61/GO/GD/05分離株生物學(xué)特性的測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 61/G O/GD/05分離株生物學(xué)特性的測(cè)定結(jié)果

2.2 對(duì)雛雞的致病性試驗(yàn) 攻毒后3 d,雞只開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病,主要表現(xiàn)為精神沉郁、羽毛松散、閉眼昏睡、癱臥在地、拉稀等癥狀。剖檢死亡雞,發(fā)現(xiàn)腺胃有出血點(diǎn)、胰腺壞死及腸道出血。雞只的死亡率和發(fā)病率見(jiàn)表2。

表2 61/GO/GD/05分離株對(duì)雞、鵝的致病性試驗(yàn) (%)

2.3 對(duì)雛鵝的致病性試驗(yàn) 攻毒后第4天鵝開(kāi)始發(fā)病,主要表現(xiàn)為精神沉郁,食欲減退。剖檢病死鵝,可見(jiàn)食管、氣管黏液增多,腸道出血,腺胃肌胃交界處輕微出血,脾臟腫大,胰腺腫大、壞死、出血(見(jiàn)圖1)。在攻毒后第7天采咽喉拭子和泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離。鵝的死亡率和發(fā)病率,見(jiàn)表2。

圖1 61/GO/GD/05分離株對(duì)鵝致病性試驗(yàn)圖譜

2.4 RT-PCR結(jié)果 對(duì)61/GO/GD/05分離株的病毒RNA進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相符,電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 F基因的PCR擴(kuò)增

2.5 F基因序列分析及基因型 將GPMV 61/GO/GD/05分離株與GenBank上13株APMV毒株的F基因進(jìn)行核苷酸序列相似性分析,發(fā)現(xiàn)61/GO/GD/05毒株與我國(guó)早期分離的GPMV SF02和ZJ1毒株相似性最高,分別為98.3%和98.0%,與Clone 30的相似性最低,為84.2%(圖3);與F48E9毒株的相似性為86.6%。基因型分析表明,該毒株為基因Ⅶ型,為我國(guó)目前主要流行基因型。F蛋白的裂解位點(diǎn)的氨基酸組成為RRQKRF,符合GPMV強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)堿性氨基酸組成的特點(diǎn)。

3 討論

本試驗(yàn)的GPMV 61/GO/GD/05分離株的MDT值為78 h,ICPI值為1.70,IVPI值為2.34。后兩項(xiàng)指標(biāo)顯示其為強(qiáng)毒力株,而MDT的結(jié)果則顯示其為中等毒力株。Gerganow等[5]也曾分離到一株NDV病毒,MDT值屬于強(qiáng)毒力型,ICPI值屬于中等毒力型,而IVPI值屬于低毒力型,3個(gè)指標(biāo)均不一致,最終該毒株毒力的判定以動(dòng)物發(fā)病試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)。本研究中的致病性試驗(yàn)表明,61/GO/GD/05分離株對(duì)21日齡雞的發(fā)病率為100%,死亡率為90%,對(duì)16日齡鵝的發(fā)病率為100%,死亡率為50%,表明該病毒對(duì)雛雞、雛鵝均具有較強(qiáng)的致病性。

此外,研究已證實(shí)GPMV的F蛋白是決定禽副黏病毒毒力的主要決定因素[6-8]。對(duì)不同毒株F基因序列分析表明,毒力不同的毒株F基因序列不同,其差異主要表現(xiàn)在F基因裂解位點(diǎn)區(qū)域。強(qiáng)毒株在裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112R-R-Q-K/R-RF117,而弱毒株或無(wú)毒株在裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112G-R/K-Q-C-R-L117,而且這一結(jié)論已經(jīng)通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)得到了證實(shí)。用此方法來(lái)鑒定NDV的強(qiáng)弱毒已經(jīng)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)采納。本試驗(yàn)的GPMV 61/GO/GD/05分離株F蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)(112-117)氨基酸的序列分析結(jié)果為RRQKRF,符合NDV強(qiáng)毒株的氨基酸序列特征。因此,綜合以上研究結(jié)果,判定GPMV 61/GO/GD/05分離株為強(qiáng)毒株。

對(duì)不同毒株的F基因序列分析表明,61/GO/GD/05毒株與我國(guó)早期分離的GPMV SF02和ZJ1毒株相似性最高,分別為98.3%和98.0%,但與我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株相似性?xún)H為86.6%。雖然目前我國(guó)廣泛使用雞新城疫常規(guī)疫苗對(duì)鵝副黏病毒病進(jìn)行預(yù)防和控制,但試驗(yàn)表明此類(lèi)疫苗的免疫效果并不理想,說(shuō)明鵝副黏病毒和LaSota株、F48E9株抗原性存在較大差異。

將GPMV 61/GO/GD/05分離株接種健康雛鵝能復(fù)制出與臨床癥狀一致的臨床癥狀和剖檢病變。該病毒的分離鑒定再次證明水禽不再僅是禽1型副黏病毒的宿主和貯存庫(kù),而是已成為禽1型副黏病毒自然感染發(fā)病、死亡的易感禽類(lèi)。分離的GPMV 61/GO/GD/05株既可引起鵝感染發(fā)病,又對(duì)雞有強(qiáng)致病性,推測(cè)這可能與長(zhǎng)期使用NDV疫苗,使得環(huán)境中免疫壓力增強(qiáng),導(dǎo)致型禽1副黏病毒發(fā)生變異及水禽(鴨、鵝)與陸禽(雞)混養(yǎng)有關(guān)[9]。

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