韋 莉,王 菁,朱珊珊,侯 磊,佘銳萍,劉 爵

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京海淀100097)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovius,PCV)最早是Tischer等于1974年在傳代細胞系PK15中發(fā)現(xiàn),該病毒可以持續(xù)感染PK15細胞,不引起細胞病變,對豬無致病性。1991年在加拿大豬群中發(fā)現(xiàn)稱之為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrom,PMWS)的病,發(fā)現(xiàn)其主要是由一種致病性豬圓環(huán)病毒引起,目前,將這種致病性PCV劃為 PCV2,而將對豬無致病的稱為PCV1。PMWS通常發(fā)生于5～12周齡的仔豬,典型癥狀包括消瘦、虛弱、呼吸困難和淋巴結(jié)腫大,急性暴發(fā)時,死亡率可達15%以上。PMWS既可水平傳播,導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)病死亡;亦可垂直傳播,引起繁殖障礙,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟損失,已引起世界各地的廣泛的重視。

PCV為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。PCV2基因組為環(huán)狀單鏈DNA,基因組分為3種,1 766 nt、1 767 nt和1 768 nt[1],病毒粒子無囊膜,呈二十面體對稱,直徑17 nm。PCV含有兩個主要閱讀框ORF1和ORF2,ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白,此蛋白在這兩型病毒之間有85%同源性,是PCV1和PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因[2]。而ORF2編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白-衣殼蛋白(Cap)的基因,此蛋白具有良好的免疫原性,且PCV1和PCV2之間不發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)[3],是檢測病毒抗體水平的良好抗原。T ruong 等[4]、Nawagitgul等[5]及 Blanchard 等[6]利用PCV2 ORF2特異性抗原表位或完整蛋白作為診斷抗原建立了PCV2 ELISA方法,并在臨床應(yīng)用中取得了較好的效果。另外,Liu等[7-8]報道一個由ORF3編碼的新蛋白質(zhì),參與宿主細胞凋亡。

由于該病毒感染細胞不出現(xiàn)細胞病變,且病毒培養(yǎng)物毒價很低、不易純化,給研究和生產(chǎn)工作帶來一定困難。20世紀80年代發(fā)展起來的桿狀病毒表達系統(tǒng),可以在昆蟲細胞內(nèi)表達蛋白質(zhì),由于表達的蛋白轉(zhuǎn)錄后加工修飾較好、生物學(xué)活性高、表達量高及安全性好等優(yōu)點[9],日益受到人們的重視,已成為研究和生產(chǎn)各種蛋白的有力工具。國內(nèi)劉長明等[10]用昆蟲桿狀病毒表達了PCV2 ORF2,但其選用蝕斑篩選重組病毒,比較繁瑣;樊惠英等[11]用Bac-to-Bac系統(tǒng)成功表達PCV2 ORF2,并形成病毒樣顆粒。本試驗?zāi)康氖抢美ハx桿狀病毒表達PCV2 ORF2基因,制備出ORF2的抗體,為今后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞株和菌種 載體 pBluescriptSKORF2 、pFast-bacHTa、E.coli DH10Bac 感受態(tài),Sf9細胞均為本組保存。

1.2 試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司,快速凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司,T4連接酶,Taq DNA polymerase購自TaKaRa公司;各種限制性內(nèi)切酶,低分子量標(biāo)準蛋白(Marker)購自BioLabs公司,辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記二抗購自Sigma公司;SF900-ⅡSFM 培養(yǎng)基購自Gibco公司;Cellfectin Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。

1.3 ORF2基因的擴增、回收 用PCR擴增完整的 ORF2基因,使用引物為:HT aORF2(5):5′-CCGCTCGAGG ATG ACG TAT CCA AGG AGG CGT TAC-3′和 H TaORF2(3):5′-GGGGTACC TTA AGG GTT AAG TGG GGG GTCTT T AAG-3′,限制性酶切位點分別為 XholⅠ和KpnⅠ用下劃線表示。50 μ L擴增體系中含 0.5 μ L pBluescriptSK-ORF2,特異性引物各 50 pmol/μ L,1μ L 10 mmol/L dNTP混合物,2.5 U的 Taq酶,5 μ L 10×PCR緩沖液(含 15 mmol/L MgCl2)。反應(yīng)程序為:94℃變性3 min;94℃35s,55℃45s,72℃1 min 30 s,共35個循環(huán);72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。用快速凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 重組桿狀病毒Bacmid-ORF2的構(gòu)建與鑒定回收的 ORF2經(jīng) XholⅠ和 KpnⅠ酶切,克隆至pFast-bacH Ta載體中,構(gòu)建pFast-bacH Ta-ORF2,將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH10Bac中,用M13公用引物和ORF2特異性引物 PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒Bacmid-ORF2,制備重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞,參照文獻[13]進行重組病毒增殖,獲得穩(wěn)定重組病毒,重組病毒命名為rBac-ORF2,4℃避光貯存。

1.5 間接IFA檢測重組病毒rBac-ORF2的表達Sf9細胞于 96孔板中長成單層后,接種 rBac-ORF2,72 h后,用PBS洗2次,冷無水乙醇固定,室溫作用30 min,再用PBS洗3次,用PCV2豬血清作為一抗50 μ L/孔,37℃孵育1 h,PBS 洗 3次,加熒光標(biāo)記羊抗豬IgG為二抗 50 μ L/孔,37℃孵育1 h,用PBS洗2～3次后,在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western-blot檢測重組病毒rBac-ORF2的表達 以重組病毒適量感染昆蟲細胞Sf9,72 h后見胞核變大,有粗糙顆粒狀,1 000 r/min離心5 min,分別收集上清與細胞,上清避光貯于4℃,細胞用預(yù)冷的裂解液重懸后,冰浴中超聲裂解,4℃,10 000 r/min,離心,30 min收集上清。常規(guī)制備樣品,12%SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉NC膜,PBS-T洗膜2次,加入適當(dāng)稀釋的一抗溶液,室溫孵育2 h,PBS-T液洗膜3次,放入適當(dāng)稀釋H RP標(biāo)記的羊抗豬IgG二抗中,室溫孵育1.5 h,PBST液洗膜3次,每次10 min。把NC膜浸入到配好的底物溶液中顯色,出現(xiàn)顏色時,立刻用蒸餾水沖洗終止反應(yīng),拍照。

1.7 目的蛋白的純化 收集的細胞用預(yù)冷的含8 mol/L尿素裂解液重懸后,冰浴中超聲裂解細胞,4℃,20 000 r/min離心30 min,收集上清。用600 μ L含8 mol/L尿素裂解緩沖液平衡Ni-NTA柱,以1 000 r/min離心5 min。在預(yù)平衡的Ni-NTA柱中注入600 μ L細胞裂解上清,其中含有6×His標(biāo)記的蛋白,1 000 r/min離心5 min并收集上清。用600 μ L含8 mol/L尿素沖洗緩沖液洗Ni-NTA柱2次,1 000 r/min離心 5 min。用200 μ L含8 mol/L尿素洗脫緩沖液抽提蛋白3次,1 000 r/min離心5 min,并收集抽提洗出液。采用透析復(fù)性的方法使變性的蛋白復(fù)性。

1.8 豚鼠抗血清的制備 注射前將提純的蛋白樣品與Seppic公司生產(chǎn)的豚鼠專用免疫佐劑等體積混合,形成乳濁液。用酒精棉球消毒豚鼠四肢,將所備樣品等量注射到豚鼠腹股溝皮下(多點注射)。2周后以同樣劑量與佐劑等體積混合,四肢肌肉注射,加強免疫1次。再2周后以同樣劑量與佐劑等體積混合后第2次加強免疫。免疫后10 d測抗體滴度,若滴度達到要求則處死豚鼠取血清,若未達到要求,則再加強免疫,經(jīng)間接ELISA檢測抗體滴度達到要求后再采血分離血清。

2 結(jié)果

2.1 重組 Bacmid質(zhì)粒的 PCR鑒定 分別用ORF2特異引物和M13引物進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)結(jié)果均與預(yù)期相符,表明Bacmid-ORF2構(gòu)建正確。

2.2 重組桿狀病毒間接免疫熒光鑒定 用帶有ORF2基因重組Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞,感染72 h后,間接免疫熒光試驗表明,在接種重組質(zhì)粒的Sf9細胞中可見到特異性的熒光(圖1)。而未接種的Sf9細胞無熒光反應(yīng)(圖2)。

2.3 ORF2蛋白的表達 將重組蛋白PCV2 ORF2轉(zhuǎn)至NC膜上進行免疫學(xué)反應(yīng),結(jié)果顯示,所表達的蛋白產(chǎn)物能被PCV2特異性血清識別,證明表達產(chǎn)物是ORF2的特異性蛋白,并且具有免疫原性(圖3)。用變性方法通過Ni-NAT柱提純,復(fù)性后,Western-blot檢測結(jié)果獲得較純的目的蛋白(圖4)。

2.4 豚鼠血清抗體滴度分析 用提純的重組蛋白免疫豚鼠,分別取免疫前、后豚鼠血清分析抗體滴度。免疫前的豚鼠血清作為一抗時,包被抗原為5 ng、10 ng、20 ng、40 ng 和 80 ng,抗體滴度1 ∶50時均出現(xiàn)陽性反應(yīng),1∶100時均無明顯陽性反應(yīng)。免疫后豚鼠血清作為一抗時,抗原量10 ng時,1∶2 000下仍有弱陽性反應(yīng);80 ng時,1∶4 000仍有明顯陽性反應(yīng),說明該制備抗體與PCV2 ORF2蛋白具有顯著的結(jié)合力。

3 討論

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染可造成豬免疫系統(tǒng)的損傷,引起感染豬的T淋巴細胞、B淋巴細胞數(shù)量減少;細胞因子的表達量改變,而且感染PCV2后,機體的免疫力下降,感染豬處于亞健康狀態(tài),其他病原如豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬細小病毒等或應(yīng)激因素如免疫刺激等多種因素都可加重PCV2感染豬的病情,進而發(fā)展成臨床癥狀和病理變化較明顯的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎和腎病綜合征等與豬圓環(huán)病毒相關(guān)的疾病。PCV2的ORF2蛋白是目前已知惟一編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白-衣殼蛋白(Cap)的基因,PCV2的表型特異性特征很可能決定于ORF2編碼的Cap蛋白。該蛋白可引起感染豬產(chǎn)生很高的抗體水平,因此是檢測病毒抗體水平的良好抗原[3]。本試驗利用分子手段將 PCV2的ORF2基因構(gòu)建到真核載體中,從而利用昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)表達出此蛋白,進而制備抗體,可用于病原的檢測及病毒的進一步研究。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)采用桿狀病毒穿梭載體技術(shù)大大縮短了病毒純化和鑒定的時間。陽性的重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞表達的ORF2蛋白進行了多種翻譯后修飾,接近于天然的病毒編碼蛋白,具有較高的生物學(xué)活性,而且桿狀病毒具有高度的種屬特異性,僅感染昆蟲細胞,對脊椎動物細胞無感染性,其表達產(chǎn)物安全可靠,經(jīng)簡單處理即可用于后續(xù)試驗。

為了獲得較好的抗體,應(yīng)選擇體重在800 g左右,身體健康的雄性豚鼠,并要注意盡量減少對動物的刺激。我們采用腹股溝皮下注射的方法進行免疫,因注射點接近腹股溝淋巴結(jié),易于激發(fā)免疫,從而制備出高價的血清抗體,以備后續(xù)試驗的進行。

[1]Shang S B,Jin Y L,Jiang X T,et al.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus,and antigenic phenotype of porcine circovirus T ype 2[J].Mol Immunol,2009,46(3):327-334.

[2]王忠田,楊漢春,郭鑫.規(guī)?；i場豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志,2002,38(10):3-6.

[3]Liu Q,Tikoo S K,Babiuk L A.Nuclear location of the O RF2 protein encoded by po rcine circovirus type 2[J].Virol,2001,285(1):91-99.

[4]T ruong C,M ahe D,Blanchard P,et al.Identification of an immunorelevant ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection[J].Arch Virol,2001,146:1197-1211.

[5]Nawagitgul P,Harms P A,Morozov I,et al.Modified indirect porcine circovirus(PCV)type 2-based and recombinant capsid protein(ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assaya for detection of antibodiese to PCV[J].Clin Diagn Lab Immunol,2002,9:33-40.

[6]Blanchard P,M ahé D,Cariolet R,et al.An ORF2 proteinbased ELISA for porcine circovirus ty pe 2 antibodies in postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Vet Microbiol,2003,94:183-194.

[7]Liu J,Chen I,Du Q,et al.T he ORF3 protein of porcine circovirus type 2 is involved in viral pathogenesis in vivo[J].J Virol,2006,80:5065-5073.

[8]Liu J,Zhu Y,Chen I,et al.The O RF3 protein of porcine circovirus ty pe 2 interacts with porcine ubiquitin E3 ligase Pirh2 and facilitates p53 expression in viral infection[J].J Virol,2007,81:9560-9567.

[9]M aeda S,Kawai T,Obinata M,et al.Production of human αinterferon in silkworm using a baculovirus vecto r[J].Nature,1985,315:592-594.

[10]劉長明,陸月華,張超范,等,豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白在昆蟲桿狀病毒中的表達[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2005,27(6):479-482.

[11]樊惠英,陳煥春,佟鐵鑄,等.豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲細胞中的表達及其特性[J].生物工程學(xué)報,2005,21(6):975-978.

[12]T omoshi N,Satoko I,Eiko S,et al.High level expression and purification of bioactive bovine interleukin218 using a baculovirus sy stem[J].Vet Immunol Immunopathol,2002,87:65-72.