何錫忠,李春華,倪建平,蔣風英,鄒 勇*

(1.上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海佳牧生物制品有限公司,上海 201106)

微載體培養(yǎng)PK-15細胞試驗條件的優(yōu)化

何錫忠1,李春華1,倪建平2,蔣風英1,鄒 勇1*

(1.上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海佳牧生物制品有限公司,上海 201106)

為了優(yōu)化PK-15細胞在微載體上的生長條件,在微載體濃度5 mg/mL、低糖DMEM+100 mL/L NBS培養(yǎng)液條件下,觀察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的細胞接種密度對細胞生長的影響;在低糖DMEM+100 mL/L NBS培養(yǎng)液、接種密度5×104cells/mg條件下,觀察3、5、10 mg/mL微載體濃度對細胞生長的影響;在3 mg/mL微載體濃度條件下、接種密度25×104cells/mL,觀察MEM、高糖DMEM和低糖DMEM培養(yǎng)基對細胞生長的影響。結果表明,以微載體接種細胞密度4.5×104cells/mg、微載體濃度5 mg/mL在低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)方式效果最為理想。優(yōu)化的培養(yǎng)工藝適用于PK-15細胞的生產。

微載體培養(yǎng);PK-15細胞;培養(yǎng)條件

目前,我國病毒性疫苗的生產多采用扁瓶和滾瓶等靜置培養(yǎng)技術進行細胞培養(yǎng)和病毒復制,勞動強度高,占地面積大,而且生產不穩(wěn)定,很難進行質量控制。Van Wezel A L[1]于1967年首先應用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細胞,此后這一技術得到了迅速發(fā)展。微載體系統(tǒng)由于具有高比表面積、細胞產量高、培養(yǎng)環(huán)境便于檢測和控制、生產規(guī)模易于放大等優(yōu)點,已廣泛應用于狂犬病、脊髓灰質炎等疫苗的生產[2-3];對80種以上的貼壁細胞成功進行了大規(guī)模擴增,如293細胞、成肌細胞、CHO 細胞、Vero細胞[3-7]、Marc細胞[8]和ST細胞[9]等。由于細胞培養(yǎng)環(huán)境和微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的操作條件影響不同細胞生長代謝和生理狀況,筆者通過研究細胞接種密度、微載體濃度和不同培養(yǎng)基種類與PK-15細胞生長的關系,考察培養(yǎng)過程中的限制性因素對PK-15細胞生長的影響,為獲得生長良好的高密度PK-15細胞培養(yǎng)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 PK-15細胞(無PCV-1污染)由上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所研發(fā)中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MEM、高糖 DMEM 和低糖DMEM為美國GIBCO-RBL公司產品;新生牛血清為Hyclone公司產品。

1.1.3 微載體(Cytodex TM 3) CT-3微載體購自Amersham pharmacia Biotch AB,使用前經無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液浸泡,1.055 kg/cm2高壓蒸汽滅菌30 min,再浸泡在含100 mL/L新生小牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)液中,置37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱過夜,待用。

1.1.4 轉瓶 由華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室制備,總體積250 mL。

1.1.5 CelliGen生物反應器 由New Brunswick Scientific Co.LTD USA 生產,工作體積1.2 L,溶解氧(DO)和 pH 由壓縮 Air、N2、O2和CO24種氣體控制,籠式攪拌槳由磁力驅動器驅動。

1.2 方法

1.2.1 靜置培養(yǎng) PK-15細胞生長至3 d～4 d后,細胞基本鋪滿方瓶時,先用含0.2 g/L EDTA的PBS清洗 2次,再加入2.5 g/L胰酶溶液消化,傾去胰酶,加低糖DMEM培養(yǎng)基,吹打,T-50方瓶以1∶3～1∶4的比率傳代。

1.2.2 微載體系統(tǒng)培養(yǎng) CT-3微載體,經無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液浸泡,1.055 kg/cm2高壓蒸汽滅菌30 min,再浸泡在含100 mL/L新生小牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基中,置37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱過夜,待用。加入適量微載體和細胞于250 mL轉瓶中,工作體積100 mL,采用間隙換液的培養(yǎng)方式,于37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),轉速度第1天為30 r/min,此后均為40 r/min～45 r/min。對影響PK-15細胞在微載體快速均勻貼壁的培養(yǎng)基、接種細胞接種密度、微載體濃度等條件進行優(yōu)化比較。

1.2.2.1 培養(yǎng)基對細胞生長的影響 在3 mg/mL微載體濃度條件下、接種密度25×104cells/mL,觀察含 100 mL/L NBS的 MEM、高糖 DMEM(DMEM-HG)100 mL/L NBS和低糖 DMEM(DMEM-LG)100 mL/L NBS培養(yǎng)基對細胞生長的影響。

1.2.2.2 細胞接種密度對細胞生長的影響 在微載體濃度 5 mg/mL、培養(yǎng)液低糖 DMEM+100 mL/L NBS條件下,從48 h開始,每12 h換液50%,觀察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的細胞接種密度對細胞生長的影響。

1.2.2.3 微載體濃度對細胞生長的影響 在優(yōu)化細胞接種密度的基礎上,在培養(yǎng)液低糖DMEM+100 mL/L NBS、接種密度5×104cells/mg條件下,自48 h開始,每 12 h換液 50%,觀察 3、5、10 mg/mL微載體濃度對細胞生長的影響。

1.2.3 生物反應器培養(yǎng)PK-15細胞 安裝好反應器和管路后,分別用pH為4.00和6.86的標準pH溶液在25℃下標定pH電極。在罐體內加入PBS液,1.055 kg/cm2高壓蒸汽滅菌45 min。冷卻后安裝到反應器控制系統(tǒng)上,連接好壓縮Air、N2、O2和CO24種氣體的氣路管線,校正DO電極后,將罐內PBS壓出,工作體積1.2 L,加入適量微載體和種子細胞,控制溶氧(DO)為40%空氣飽和度,攪拌速度為40 r/min～55 r/min,溫度為37℃,pH 7.0。籠式攪拌槳由磁力驅動器驅動。

1.2.4 活細胞計數(shù) 方瓶中的單層細胞經胰酶消化、重懸后,直接用血細胞計數(shù)板計數(shù);微載體上的細胞先用PBS漂洗2次,用含10 g/L結晶紫的檸檬酸溶液染色,用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞核。

2 結果

2.1 靜置法培養(yǎng)PK-15細胞的生長

在方瓶中PK-15細胞的最高密度達到1.78×106cells/mL,細胞擴增了3.6倍。對數(shù)生長期的平均細胞比生長速率約為每天0.59,最高比生長速率為每天0.74。

2.2 不同培養(yǎng)基對PK-15細胞生長的影響

由表1可知,在3 mg/mL微載體濃度條件下、接種密度25×104cells/mL,采用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞所能達到最終細胞密度為1.8×106cells/mL,比 MEM 高30%,比高 糖DMEM 高22%。

表1 不同培養(yǎng)基對PK-15細胞生長的影響Table 1 Effect of different media on g rowth of on PK-15 cells

2.3 不同細胞接種密度對PK-15細胞生長的影響

由表2可知,在培養(yǎng)液低糖DMEM+100 mL/L NBS、5 mg/mL的相同微載體濃度下,PK-15細胞接種密度為4.5×104cells/mg MC和8.7×104cells/mg MC時,所能達到的最高細胞密度分別為2.90×106cells/mL和3.74×106cells/mL,擴增倍數(shù)分別為12.1和 8.6倍。

表2 不同細胞接種密度對PK-15細胞生長的影響Table 2 Effect of densities of cells inoculated on growth of PK-15 cells

2.4 不同微載體濃度對PK-15細胞生長的影響

由表 3可知,在培養(yǎng)液低糖 DMEM+100 mL/L NBS、接種密度5×104cells/mg條件下,隨著微載體濃度提高,細胞密度也相應提高。用相同的表面積細胞密度接種,3、5、10 mg/mL微載體濃度所能達到的最高細胞密度分別為1.67×106、3.14×106、5.91×106cells/mL。

表3 不同微載體濃度對PK-15細胞生長的影響Table 3 Effect of microcarrier concentrations on growth of PK-15 cells

2.5 不同規(guī)格生物反應器培養(yǎng)PK-15細胞的生長

由表4可知,在低糖-DMEM、5 g/L微載體濃度和5×104cells/mg MC細胞接種密度條件下進行1 L和5 L生物反應器中PK-15細胞培養(yǎng),在接種后第5天達到最高細胞密度分別為3.25×106cells/mL和3.36×106cells/mL,細胞擴增了13倍,差異不顯著。

表4 不同規(guī)格生物反應器培養(yǎng)PK-15細胞的生長情況Table 4 Grow th of PK-15 cells in different bioreacto r

3 討論

本試驗比較了 MEM、高糖 DMEM和低糖DMEM 培養(yǎng)基對細胞生長的影響,結果發(fā)現(xiàn),采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細胞所能達到最終細胞密度為1.8×106/mL,比MEM 高30%,比高糖DMEM高22%。代謝分析表明,低糖DMEM中葡萄糖利用率明顯比高糖DMEM高,這是因為更多的葡萄糖轉化為細胞生長提供能量和物質來源[10],而在高糖培養(yǎng)環(huán)境中,代謝過程中所多余的葡萄糖生成乳酸是其他培養(yǎng)液的 5倍[11],氨離子濃度最低,因此在長時間(36 h以上)培養(yǎng)時,應采用間歇換液的方式,以消除代謝產物給細胞生長帶來的不利影響[12-13]。這正是低糖DMEM和高糖DMEM培養(yǎng)基引起細胞生長和最高細胞密度出現(xiàn)差異的根本原因。

研究表明,PK-15細胞生長與細胞表面積接種無相關性。當接種密度為為4.5×104cells/mg MC和8.7×104cells/mg MC時,最高細胞密度并沒有因細胞接種密度的翻倍而成倍的增加,僅增加了28%。高密度接種時,細胞更容易進入對數(shù)生長期,但高密度接種的細胞受到的接觸抑制作用程度比低密度接種的更強,使得細胞比生長速率較快下降。因此,PK-15細胞培養(yǎng)過程中為使培養(yǎng)過程能保持較高的細胞比生長速率,并獲得更高的細胞擴增倍數(shù),提高培養(yǎng)過程的效率,同時可以減少種子細胞的制備量。以4.5×104cells/mg MC左右為宜。

隨著微載體濃度增加,最高細胞密度也相應增加,3、5、10 mg/mL 的載體,其面積比為1∶1.7∶3.3,但相應的細胞密度比卻為1∶1.8∶3.6,說明微載體濃度與 PK-15細胞密度僅有一定程度的相關性。微載體濃度越高,細胞生長期越長,采用10 mg/mL微載體培養(yǎng)至第6天才達到最高細胞密度,高濃度微載體的表面積未能充分被利用。為了更快更經濟地獲得較高密度的健康細胞,在大規(guī)模培養(yǎng) PK-15細胞時,應選擇5 mg/mL的微載體濃度。

應用生物反應器系統(tǒng)和微載體技術培養(yǎng)PK-15細胞,在細胞密度、擴增倍數(shù)、比生長速率等方面均優(yōu)于靜置和轉瓶培養(yǎng)。

[1]Van Wezel A L.Growth of cell strains and primary cells on microcarrier in homogeneous culture[J].Nature,1967,216:64-65.

[2]Reuveny S.Advances in biotechnological processes[M].New York:Alan R Liss Inc,1983:1-13.

[3]王樹君,代長海,張 瑩,等.用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)Vero細胞生產高滴度狂犬病毒液[J].中國生物制品學雜志,2004,17(6):380-382.

[4]李平忠,沈 偉,余 芬,等.用微載體培養(yǎng)Vero細胞制備狂犬病疫苗[J].第三軍醫(yī)大學學報,2006,28(23):2374-2376.

[5]孫明波,李國良,李衛(wèi)東,等.應用生物反應器培養(yǎng) Vero細胞制備甲肝病毒[J].第三軍醫(yī)大學學報,2003,25(8):740-741.

[6]高 軍,周荔葆,白珠穆,等.應用生物反應器制備人用乙型腦炎純化疫苗[J].生命科學儀器,2008(6):50-53

[7]樂 威,葉林柏,張 捷,等.微載體灌注培養(yǎng)制備Vero細胞狂犬病疫苗[J].中國病毒學,2004,19(4):373-375.

[8]宮 飛,朱明龍,周 燕,等.微載體培養(yǎng) Marc細胞實驗條件的優(yōu)化[J].中國生物制品學雜志,2007,20(5):372-375.

[9]周 燕,王建超,華 平,等.豬傳染性胃腸炎病毒在ST細胞中增殖規(guī)律的研究[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(6):423-427.

[10]Linz M,Zeng A P,Wagner R,et al.Stoichiometry,kinetics,and regulation of glucose and amino acid metabolism of a recombinant BHK cell line in batch and continous cultures[J].Biotechnol Prog,1997,13(4):453-463.

[11]Zielke H R,Ozand P T,Tildon J T,et al.Reciprocal regulation of glucose and glutamine utilization by cultured humar diploid fibroblast[J].J Cell Physiol,1978,95(1):41-48.

[12]Ray N G,Karkare S B,Runstadler P W.Cultivation of hybridoma cell in continuous:kinetics of growth and product formation[J].Biotechnol Bioeng,1989,33(6):724-730.

[13]Zielke H R,Zielke C L,Ozand P T.Glutamine:a major energy source for cultured mammalian cell[J].Fed Proc,1984,43(1):121-125.

Optimization of Condition for Culture of PK-15 Cell by Microcarrier

HE Xi-zhong1,LI Chun-hua1,NI Jian-ping2,JIAG Feng-ying1,ZOU Yong1

(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai,201106,China;2.Shanghai J iamu Biological Production Co.,L TD,Shanghai,201106,China)

The aim of this study is to optimize the cultural condition of PK-15 cell by microcarrier system.On the condition of 5 mg/mL microcarrier concentration and low sugar DMEM containing 100 mL/L NBS as culture fluid,the effects on PK-15 cell growth at 4.5×104cells/mL and 8.7×104cells/mL inoculation density were observed.On the condition of low sugar DMEM containing 100 mL/L NBS as culture fluid and the 5×104cells/mg inoculation density,the effects on PK-15 cell growth at 3,5,10 mg/mL microcarrier concentration were observed.On the condition of 3mg/mL microcarrier concentration and the 25×104cells/mL inoculations density,the effects on PK-15 cell grow th by using MEM,high sugar DMEM or low sugar DMEM as culture fluid were observed.The results showed that the optimal culture conditions were 4.5×104cells/mg inoculation density,5 mg/mL microcarrier concentration,and low sugar DMEM as culture fluid.Optimal cultural technology could apply for the production of PK-15 cell.

microcarrier culture(MC);PK-15 cell;culture condition

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0020-04

2009-12-31

資金項目:上海市科委科技發(fā)展基金項目(04391930)

何錫忠(1966-),男,上海人,獸醫(yī)師,碩士,主要從事獸用疫苗研究。*通訊作者