徐引弟,王治方,朱文豪,梁 躍,郭成留

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002)

豬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗*

徐引弟,王治方,朱文豪,梁 躍,郭成留

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南鄭州 450002)

從2006年-2009年河南省發(fā)生的豬高熱綜合征的168家規(guī)?；i場456份病料中分離出革蘭陰性小桿菌,通過培養(yǎng)特性、生化試驗和PCR檢測,結(jié)果鑒定出25株豬支氣管敗血波氏桿菌。結(jié)果顯示,所分離的豬支氣管敗血波氏桿菌對小鼠均有毒力,對阿齊霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星敏感。

豬支氣管敗血波氏桿菌;分離;鑒定;藥敏試驗

支氣管敗血波氏桿菌 (Bordetella bronchi-septica,Bb)可引起豬發(fā)生非進行性萎縮性鼻炎(non-progressive atrophic rhinitis,NPAR)和支氣管肺炎,也是豬呼吸道綜合征(Porcine respiratorydisease complex,PRDC)的重要致病因子之一[1-2]。斷奶前仔豬感染Bb,可發(fā)生NPAR和支氣管肺炎,引起鼻甲骨萎縮。斷奶后仔豬感染主要表現(xiàn)為打噴嚏及鼻塞,不產(chǎn)生或者只產(chǎn)生輕度的鼻甲骨萎縮。這兩種情況下如果繼發(fā)了產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌,則會發(fā)生更嚴重的進行性萎縮性鼻炎[3-4]。2006年6月以來我國暴發(fā)的高熱綜合征給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失,高熱綜合征主要由高致病性豬藍耳病病毒引起,同時有圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬流感病毒和偽狂犬病毒的感染,細菌性病原如豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、大腸埃希菌、波氏桿菌、巴氏桿菌等繼發(fā)感染和混合感染,波氏桿菌是主要的細菌性感染之一[5-8]。

本試驗通過對河南省規(guī)?；i場豬支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗,為預(yù)防和控制該病的流行提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 從2006年9月至2009年12月河南省發(fā)生的高熱綜合征的168個豬場共采集的病豬的肺、心血、腦、脾臟、淋巴結(jié)等共456份病料。

1.1.2 主要試劑及儀器 TSA(T ryptic soy agar)、TSB(Tryptic soy broth)購自 Difco公司;麥康凱(MC)瓊脂、革蘭染色液購自鄭州理利生物公司;生化管、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司;TaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品;PCR儀為Touchgene公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱均為REVCO產(chǎn)品;E200-F三目生物顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離純化 將病料接種于加血清和NAD的TSA培養(yǎng)基,置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)過夜,挑取圓形、透明、直徑1 mm～2 mm的粉紅色可疑菌落。取上述菌落抹片革蘭染色后在顯微鏡下觀察,挑取革蘭陰性小桿菌菌落于TSA平皿純化。

1.2.2 生化試驗 對可疑菌落進行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、鳥氨酸、賴氨酸、谷氨酸脫羧酶、枸櫞酸、明膠、甲基紅、VP、吲哚半固體等生化試驗。

1.2.3 PCR鑒定 將上述初步鑒定的細菌進一步用PCR方法確定。用接種環(huán)取少許被檢菌落于100 μ L無菌 PBS,混勻 ,取 1 μ L 菌懸液作 PCR 模板。參照文獻[9],根據(jù)波氏桿菌 fla基因(NO.AF232939)序 列 設(shè) 計 引 物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,擴增片段大小為 235 bp,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng) 體 系(50 μ L):10 ×緩沖 液 5 μ L,2 mmol/L dNTPs 1 μ L,10 μ mol/L 上下游引物各 1 μ L,TaqE 1 μ L,模板 1 μ L,滅菌 ddH2O 40 μ L 。 反應(yīng) 條件:94℃變性4 min;94℃1 min,59℃1 min,72℃30 s,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳。PCR產(chǎn)物回收后測序。

1.2.4 小鼠毒力試驗 將分離菌株接種TSB培養(yǎng)基,37℃、250 r/min振搖培養(yǎng)12 h。用生理鹽水稀釋菌數(shù)約為109cfu/mL,小鼠腹腔注射0.2 mL;同時設(shè)生理鹽水陰性對照。接種后觀察發(fā)病及死亡情況,剖檢小鼠,無菌取其心血分離細菌并鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 將分離鑒定好的菌接種于TSA平板,涂勻、選取相應(yīng)的抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上。于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,測量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性與鏡檢

在TSA培養(yǎng)基上長成直徑1 mm～2 mm灰白、透明光滑菌落,在血平皿上灰白色不溶血小菌落,在MC培養(yǎng)基生長良好,呈微紅色,直徑1 mm～1.5 mm不透明粉紅色菌落。革蘭染色均為陰性短桿菌或球桿菌,多散在,極少呈短鏈狀。

2.2 生化試驗

所有碳水化合物發(fā)酵試驗均為陰性,氧化酶、脲酶、檸檬酸鹽、鳥氨酸、賴氨酸、谷氨酸脫羧酶、枸櫞酸陽性,有運動性,硝酸鹽還原、吲哚、甲基紅、VP陰性,不液化明膠。結(jié)果表明,分離的可疑菌符合豬支氣管敗血波氏桿菌的生化特征。

2.3 PCR鑒定

對上述經(jīng)鑒定的可疑菌進行豬支氣管敗血波氏桿菌的PCR鑒定,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,證實大小均與預(yù)期大小一致(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分別與波氏桿菌fla基因(NO.AF232939)序列100%同源性(序列略)。測序結(jié)果表明所擴增序列同源性高,引物設(shè)計合理,可用于病原菌的快速鑒定。

綜合以上鑒定結(jié)果,共鑒定出豬支氣管敗血波氏桿菌25株,其中分離自肺21株,心血4株。

圖1 Bb PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR results of Bb

2.4 小鼠毒力試驗

接種小鼠24 h內(nèi)死亡,取死亡鼠心血接種MC瓊脂平皿。結(jié)果分離出純的經(jīng)鑒定與以上一致的細菌,證明為豬支氣管敗血波氏桿菌并對小鼠有致病性。

2.5 藥敏試驗

從藥物敏感試驗結(jié)果看,對大部分豬支氣管敗血波氏桿菌敏感的藥物有阿齊霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星。而對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、青霉素G、氨芐西林、萬古霉素、氯霉素、新霉素、阿莫西林、克林霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、痢特靈等抗菌藥物的敏感度低。

3 討論

本試驗從2006年9月至2009年12月河南省發(fā)生高熱綜合征的168家豬場共采集的456份病料中,共分離到25株豬支氣管敗血波氏桿菌。在所有分離的致病菌中排第 4(排在鏈球菌、副豬嗜血桿菌、大腸埃希菌之后),是高熱綜合征細菌性病原的四大病原之一[10],與文獻[11]的報道一致。從所采取的病料看,由于高熱綜合征主要表現(xiàn)在呼吸道,關(guān)節(jié)腫大跛行、后肢癱瘓的病例較多,部分病例出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,因此采取的肺病料較多,其次為心血、關(guān)節(jié)液,而波氏桿菌主要分離自肺。從混合感染或繼發(fā)情況看,某一個豬場或某一頭豬或單獨一個臟器只感染單一細菌的情況較少,多數(shù)為2種、3種細菌混合感染,甚至 4種以上細菌混合感染的情況。單獨感染波氏桿菌的情況很少,波氏桿菌主要與副豬嗜血桿菌、鏈球菌、大腸埃希菌、巴氏桿菌等混合感染。盡管體外藥敏試驗?zāi)苷业缴贁?shù)對幾種主要病原菌敏感的藥物,但是這些不能完全替代體內(nèi)的試驗結(jié)果,而且由于混合感染和多重感染的普遍存在,使得這些體外敏感的藥物在臨床上使用效果不佳。另外,由于大部分豬場長期在飼料或飲水中添加或注射多種大量的抗生素,使得細菌的抗藥性越來越強。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofBordetella bronchiseptica

XU Yin-di,WANG Zhi-fang,ZHU Wen-hao,LIANG Yue,GUO Cheng-liu

(Institute for Animal Husbandry and Veterinary Research,Henan Acadmy of Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan,450002,China)

Gram negative small bacilli were isolated from 456 samples of 168 pig farms in Henan province which had high fever syndrome from 2006 to 2009.These strains were identified base on culture characteristics,biochemical and PCR assay.The result showed that there were 25Bordetella bronchiseptica(Bb)strains.The virulence and drug sensitivity test results showed that these Bb strains were lethal to mice and sensitive to azithromycin,ciprofloxacin and amikacin.

Bordetella bronchiseptica;isolation;identification;drug sensitivity test

S858.28

B

1007-5038(2010)08-0110-03

2010-03-01

資金項目:河南省科技攻關(guān)項目(072102140004);河南省農(nóng)科院孵化項目(200712)

徐引弟(1974-),女,湖北浠水人,副研究員,博士,主要從事動物病原微生物學(xué)研究。