許曉路，孫金艷，徐冬梅

(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015)

稀土是一種具有特殊性質(zhì)的礦產(chǎn)資源，在工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、國防和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1-3］。我國稀土資源豐富，稀土儲量及產(chǎn)量均居世界首位。自1984年以來，我國稀土的年產(chǎn)量增長率均在20%以上，尤其以石化、印染、制革及農(nóng)業(yè)的應(yīng)用發(fā)展最為迅速［4］。這使得稀土元素及其化合物大量進入環(huán)境，特別是隨著工業(yè)廢水的排放和農(nóng)田地表徑流進入水體，對水生生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在威脅，并通過食物鏈而影響人類健康。

綠藻是水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者，關(guān)系到水體生產(chǎn)力和水體生態(tài)平衡。藻類對于外來物質(zhì)的刺激反應(yīng)十分敏感，環(huán)境變化會出現(xiàn)藻類種群結(jié)構(gòu)及生物多樣性的變化，從而引起水質(zhì)的相應(yīng)變化。同時藻類對富營養(yǎng)水體的凈化起著重要作用，其中某些種類，特別是小球藻屬的存在與否可作為水質(zhì)評價的重要指標［5-6］。鈰是應(yīng)用較多的稀土元素之一。本研究通過綠藻模擬培養(yǎng)試驗，在不同的鈰濃度下測定綠藻的半數(shù)效應(yīng)濃度 (EC50)、生物量、葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量及若干理化指標，為污染物排放標準和環(huán)境質(zhì)量標準制定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試劑

稀土鈰購自北京有研稀土新材料股份有限公司，用少量濃硝酸將氧化鈰溶解再用蒸餾水稀釋，配置成質(zhì)量濃度為2 000 mg·L-1的標準硝酸鈰溶液作為母液備用。

硫酸銨 (NH4)2SO4、硫酸鎂 (MgSO4·H2O)、土壤浸出液、碳酸氫鈉 (NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、氯化鐵 (FeCl3)1%(m/m)、過磷酸鈣、90%丙酮、考馬斯亮藍 G-250試劑、對二甲苯、95%乙醇、牛血清蛋白、濃硝酸、pH值7.8的磷酸緩沖液均為分析純。

1.2 實驗藻類

斜生柵藻及蛋白核小球藻購自中國科學(xué)院水生生物研究所。培養(yǎng)基為水生4號 (HB-4)人工培養(yǎng)液［7］:(NH4)2SO40.20 g·L-1，過磷酸鈣 0.03 g·L-1，MgSO4·H2O 0.08 g·L-1，NaHCO30.10 g·L-1，KCl 0.025 g·L-1， 1%FeCl3(m/m)0.15 mL，土壤浸出液0.50 mL。將藻種在無菌條件下接種至水生4號人工培養(yǎng)液中，于智能人工氣候箱恒溫光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并進一步擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)方法:用1 000 mL三角瓶，移取400～600 mL水生4號人工培養(yǎng)液，接種藻種使之成淡綠色。用4層紗布封口以防污染，培養(yǎng)溫度為(24±1.0)℃，4 500～5 000 lx連續(xù)靜止培養(yǎng)。每天定時搖動4～5次，以減少水藻細胞貼壁現(xiàn)象，并盡可能保證對藻液光照均勻。為防止藻種老化，10 d接種1次。

1.3 儀器與設(shè)備

JY92-2 D超聲波細胞粉碎機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)、JI KA-1000臺式離心機、AvantiJ-E立式大容量冷凍離心機、制冰碎冰機、智能人工氣候箱 (寧波海曙賽福實驗儀器廠)、超純水機、PB-10 E PH計、LDZX-40Ⅱ型 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠)、CS101-3 EB電熱鼓風干燥器、KSW電阻爐溫度控制器4-10(沈陽市節(jié)能電爐長)、101 A-3B型 電熱鼓風干燥箱 (上海市實驗儀器總廠)、BS224S電子天平、UV-2450紫外/可見分光光度計、SKF-6 A超聲波清洗器、SW-CJ-1 F單人雙面凈化工作臺、HI9142溶解氧儀。

1.4 急性毒性實驗的綠藻培養(yǎng)

取進入對數(shù)生長期藻液作為接種藻液，各處理組加入不同量的硝酸鈰溶液 (表1-2)。光照時間16 h，黑夜8 h，光照強度4 500～5 000 lx，培養(yǎng)溫度為 (24±1.0)℃連續(xù)靜止培養(yǎng)。每個處理濃度設(shè)置3個平行。

表1 蛋白核小球藻的急性實驗設(shè)計

分別于培養(yǎng)24，48，72，96 h后取樣，在波長689 nm處測定藻液光密度，建立不同藻類細胞密度 (105，縱坐標)和光密度 (橫坐標)之間線性關(guān)系，以計數(shù)的藻細胞濃度和光密度表示藻生物量，通過兩者線性關(guān)系進行檢驗。

1.5 慢性毒性實驗的綠藻培養(yǎng)

取進入對數(shù)生長期藻液作為接種藻液，各處理組加入不同量的硝酸鈰溶液 (表3-4)。光照時間16 h，黑夜8 h，光照強度4 500～5 000 lx，培養(yǎng)溫度為 (24±1.0)℃，連續(xù)靜止培養(yǎng)。每個處理濃度設(shè)置3個平行。測定培養(yǎng)96和192 h時的吸光度。并在192 h后按實驗設(shè)計測定其它指標。

表2 柵藻的急性實驗設(shè)計

表3 蛋白核小球藻的慢性實驗設(shè)計

表4 柵藻的慢性實驗設(shè)計

1.6 藻細胞計數(shù)

采用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，計算方法:藻細胞 (mL)=(N/5×25)/10-5×n。

式中:N表示5個中方格內(nèi)數(shù)得藻細胞數(shù);10-5為計數(shù)室的體積;n為藻液的稀釋倍數(shù)。

1.7 綠藻急性毒性即96 h半效應(yīng)濃度測定

藻生物量的測定:分別取藻原液 0，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00 和 10.00 mL定容至10 mL，再分別測定各濃度下的藻液吸光值，并且用血球計數(shù)板對各濃度下的藻細胞進行計數(shù)，最后根據(jù)吸光度和細胞數(shù)做出生物量標準曲線。

光密度測定:取待測藻液5 mL，在波長 λ=689 nm處測其光密度。

半效應(yīng)濃度:硝酸鈰對淡水綠藻的毒性試驗采用有毒化學(xué)品對藻類的毒性測試的標準方法［8］確定硝酸鈰對淡水綠藻的96 h半效應(yīng)濃度，初步試驗使硝酸鈰呈幾何級數(shù)增加，用預(yù)實驗計算出抑制淡水綠藻的96 h半效應(yīng)濃度。正式試驗硝酸鈰濃度以初步確定的96 h EC50為中點，各向兩邊以等差數(shù)列形式延伸濃度并和一組對照同時進行測定［8-9］。96 h半效應(yīng)濃度越大說明淡水綠藻對硝酸鈰抵抗能力越強，反之則說明敏感性越大。

1.8 藻液可溶性蛋白含量的測定

可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定，以小牛血清蛋白作標準曲線［10］。具體測定步驟如下:已測定光密度的藻液40 mL放入離心管→12 000 r·min-1下離心30 min，倒出離心清液，將離心管倒置滴干→加入3 mL 0.05 mol·L-1pH值7.8的磷酸緩沖液，冰浴→超聲波細胞破碎儀破碎30 min，鏡檢無完整藻細胞→定容到5 mL，離心，取上清液→595 nm處測吸光度。以 mg·g-1表示［11］。

標線制作方法:配制100 μg·mL-1標準蛋白、0.15 mol·L-1NaCl溶液及考馬斯亮藍試劑，取7只試管按表5加入各試劑后在595 nm下測定吸光度。

小牛血清蛋白標線:y=1.660 6 x+0.009 4，R2=0.990 4。

表5 小牛血清蛋白標準曲線制作方法

1.9 葉綠素含量的測定

藻液抽濾 (離心)后轉(zhuǎn)入具塞刻度試管迅速轉(zhuǎn)移至冰箱冷凍室-20℃冷凍過夜，取出后立即加入預(yù)熱80℃的10 mL95%乙醇萃取，并在恒溫水浴鍋中80℃萃取2 min，緊接著在超聲波細胞粉碎儀上 (冰浴)中進行浮游植物細胞粉碎 (300 W，3，5，50 s)，在冰箱4℃下黑暗靜置4 h后于80-2型臺式離心機4 000 r·min-1離心10 min，取上清液待測［12］。

測定方法:用光徑1 cm比色皿于波長665 nm和750 nm處測吸光值，然后加3滴1 mol·L-1鹽酸酸化，1 min后于波長665 nm和750 nm處再測吸光值。

計算方法:c(Chl-a乙醇)=27.9×［(D665，D-D750， D)- (D665， B-D750， B )］ ×V乙醇/V水樣。

式中:c(Chl-a乙醇)為乙醇法測定的葉綠素a質(zhì)量濃度 (μg·L-1);A665，D和 D750，D分別為乙醇萃取液酸化前于665 nm和750 nm處的吸光值;D665，B和D750，B分別為乙醇萃取液酸化后于665 nm和750 nm處的吸光值，V乙醇為乙醇萃取液的體積 (mL)，V水樣為離心水樣的體積 (L)。

1.10 其它理化指標的測定

用溶解氧儀和pH計在培養(yǎng)192 h后測定相應(yīng)指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻細胞生物量

隨著鈰濃度增加，蛋白核小球藻和柵藻生物量不斷增加，兩者呈線性相關(guān) (表6)。

表6 蛋白核小球藻和柵藻生物量

蛋白核小球藻生物量曲線:y=210.5x+2.201，R2=0.993 3。

柵藻生物量曲線:y=126.78x+0.121 1，R2=0.994 4。

2.2 96 h半數(shù)效應(yīng)濃度

對淡水綠藻進行急性毒性實驗以確定半數(shù)效應(yīng)濃度EC50即為50%藻生長抑制率=(空白吸光度-處理吸光度)/空白吸光度 ×100%［13］。

以蛋白核小球藻的96 h時測定的3組平行光度的平均值為 y，以硝酸鈰濃度為 x，即 y=0.001 7 x+0.313 9，R2=0.316 1。可見，硝酸鈰對蛋白核小球藻的毒性在0～10 mg·L-1時急劇下降，在10～20 mg·L-1時變化較緩。其96 h半數(shù)效應(yīng)濃度為29.9 mg·L-1。

以柵藻的96 h時測定的3組平行光度的平均值為 y，以硝酸鈰濃度為 x，即 y=0.001 5 x+0.261 4，R2=0.554 5?？梢?，硝酸鈰對柵藻的毒性作用，在0～10 mg·L-1時毒性作用明顯增強，隨后趨緩，20～40 mg·L-1時作用明顯。其96 h半數(shù)效應(yīng)濃度為63.6 mg·L-1。

2.3 藻液可溶性蛋白含量

蛋白質(zhì)含量是表征細胞狀態(tài)的重要指標。本研究將細胞破碎后通過吸光度對蛋白質(zhì)含量進行了測定，探究硝酸鈰對藻類蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果(圖1-2)表明，硝酸鈰濃度10 mg·L-1處理后藻液的可溶性蛋白含量變化不明顯。

2.4 葉綠素含量

綠藻的葉綠素含量代表其光合作用能力。在作用192 h后測其含量發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)明顯差異，表明生物量、水體自凈能力受到明顯影響 (圖3-4)。

從圖3可見，硝酸鈰濃度從0～10 mg·L-1其葉綠素含量下降迅速，尤其是在2.5～5.0 mg·L-1的毒性作用最大，其它濃度范圍則變化較為平緩。圖4顯示，硝酸鈰濃度在2.5 mg·L-1時可促進葉綠素含量的增長，2.5～5.0 mg·L-1時急劇下降，5～10 mg·L-1無明顯變化，其它濃度都存在平緩下降趨勢。綠藻的葉綠素含量代表其光合作用能力。高濃度的硝酸鈰影響綠藻，水體的自凈能力受到明顯影響。

2.5 理化指標

2.5.1 pH值

Ce(NO3)3·6 H2O母液的 pH值為4.55。但加入培養(yǎng)基后pH值都有了不同程度的增加。

圖1 蛋白核小球藻蛋白質(zhì)吸光度

圖2 柵藻蛋白質(zhì)吸光度

圖3 蛋白核小球藻葉綠素含量

從圖5可見，培養(yǎng)基對硝酸鈰有一定的緩沖作用，能使其p H值增大。但是隨著濃度的增加，培養(yǎng)基的緩沖作用能力下降。圖6表明，培養(yǎng)基對硝酸鈰的緩沖作用并不明顯。

2.5.2 溶解氧

圖4 柵藻葉綠素含量

圖5 蛋白核小球藻的pH值

圖6 柵藻的pH值

溶解氧 (DO)是水生生物生存不可缺少的條件，反映了水體自凈能力。溶解氧的一個來源是水中溶解氧未飽和時，大氣中的氧氣向水體滲入;另一個來源是水中植物通過光合作用釋放出的氧。溶解氧除了被水中硫化物、亞硝酸根、亞鐵離子等還原性物質(zhì)所消耗外，同時也被水中微生物的呼吸作用以及水中有機物質(zhì)被好氧微生物的氧化分解所消耗。對于人類而言，健康的飲用水中溶解氧含量不得小于6 mg·L-1。氧對水中生物如魚類的生存有著至關(guān)重要的影響，當溶解氧低于4 mg·L-1時，就會引起魚類窒息死亡 (圖7-8)。

圖7 蛋白核小球藻的溶解氧

圖8 柵藻的溶解氧

從圖7-8可見，相同濃度硝酸鈰對不同藻類作用不同。但當硝酸鈰濃度達10 mg·L-1以上時水體溶解氧含量在5.8 mg·L-1以下，值得關(guān)注。

3 小結(jié)

已有研究表明，稀土元素對藻類也屬中、低毒性，且低濃度時反而有一定的刺激生長作用。稀土對水生藻類等水生植物生長的影響，一般取決于稀土元素種類本身，而與其化合物類型則關(guān)系不大。本次實驗發(fā)現(xiàn):低濃度的硝酸鈰對綠藻的生長有一定的促進作用。隨著濃度的增大，它的抑制作用開始顯現(xiàn);隨著藻體生物量的變化，其葉綠素、蛋白質(zhì)含量也隨之增減;水體p H值有所上升。

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