趙鴻

（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，北京 100041）

干擾素（interferon，IFN）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，也是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的基因工程產(chǎn)品。根據(jù)其來(lái)源、理化性質(zhì)、氨基酸序列和生物學(xué)活性的不同，可分為α、β、γ三種類型。IFN的作用具有種屬特異性，其主要功能有抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)NK、Tc細(xì)胞的活性及進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，是一類重要的細(xì)胞因子。通常干擾素生物活性測(cè)定方法是采用《中國(guó)藥典》三部附錄ⅩC細(xì)胞病變抑制法（結(jié)晶紫染色法，方法一）。由于日常實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)生物活性測(cè)定曲線不理想，重復(fù)性較差，故對(duì)其操作進(jìn)行一些改動(dòng)，同時(shí)考慮到該實(shí)驗(yàn)中間操作較多，容易引入操作誤差，故探討一種中間操作少的方法，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。MTT比色法（方法二）廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物活性檢測(cè)，故筆者旨在通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)改進(jìn)的結(jié)晶紫染色法與MTT比色法哪一種方法更適合用于干擾素生物活性的測(cè)定，得到更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為干擾素的臨床應(yīng)用提供有力的保證。

1 材料與方法

1.1 原理

1.1.1 方法一原理 根據(jù)干擾素能刺激某些指示細(xì)胞，如人羊膜上皮細(xì)胞（WISH細(xì)胞）、人喉癌細(xì)胞（Hep2細(xì)胞）、人胚肌皮細(xì)胞和肺單層細(xì)胞（2BS細(xì)胞）等，產(chǎn)生抗病毒蛋白，使細(xì)胞免受牛水泡性口炎病毒（VSV）的攻擊。根據(jù)待測(cè)樣品干擾素不同稀釋度的保護(hù)能力，計(jì)算出干擾素的生物活性單位。

1.1.2 方法二原理 MTT比色法的基本原理是活細(xì)胞線粒體中富含琥珀酸脫氫酶，氧化型MTT進(jìn)入細(xì)胞后可被該酶還原生成藍(lán)色formazan顆粒，沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)溶劑溶解后比色定量，其顏色深淺直接與活細(xì)胞數(shù)有關(guān)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、材料與實(shí)驗(yàn)器具

1.2.1 DMEM培養(yǎng)液 取DMEM培養(yǎng)基粉末1袋（Gibco公司，規(guī)格為1 L，批號(hào)31600-034），加水溶解并稀釋至1 000 ml，加青霉素1.0×105U和鏈霉素10.×105U，再加碳酸氫鈉2.0 g、L-谷氨酰胺 0.292 3 g（Sigma公司， 批號(hào) G3126）、HEPES 2.838 g（Amersco公司）溶解后，混勻，過(guò)濾除菌，4℃保存。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)液（10%）取新生牛血清10 ml（四季青生物公司，批號(hào)061202），加DMEM培養(yǎng)液至100 ml，4℃保存。

1.2.3 測(cè)定培養(yǎng)液（7%）取新生牛血清7 ml，加DMEM培養(yǎng)液至 100 ml，4℃保存。

1.2.4 攻毒培養(yǎng)液（2%）取新生牛血清2 ml，加DMEM培養(yǎng)液至 100 ml，4℃保存。。

1.2.5 消化液 0.5%胰蛋白酶消化液∶0.02%EDTA=1∶1（0.5%胰蛋白酶及0.02%EDTA均用PBS溶液配制）。

1.2.6 染色液 結(jié)晶紫染色液（0.1 g+20 ml無(wú)水乙醇溶解后加水至 100 ml）。

1.2.7 脫色液 50%無(wú)水乙醇、50%蒸餾水及0.1%乙酸。

1.2.8 細(xì)胞 WISH細(xì)胞。

1.2.9 VSV-70℃凍存。

1.2.10 裂解液 取十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純）15 g，用適量蒸餾水和50 ml DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，加蒸餾水至100 ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.7。

1.2.11 MTT溶液 取0.5 g MTT，加 PBS溶解成 100 ml，配制成0.5%MTT溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。4℃避光保存。

1.2.12 PBS溶液 取8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鉀加蒸餾水配成1 000 ml溶液，經(jīng)121℃15 min高壓滅菌。

1.2.13 干擾素α活性測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品 批號(hào)97/04，-20℃貯存，7 500 IU/支。

1.2.14 器材 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板若干個(gè)，百級(jí)工作臺(tái)，二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋公司），酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司），生物倒置顯微鏡（COIC，重慶光學(xué)儀器廠），單道微量移液器，8道微量移液器，無(wú)菌1.5 ml塑料離心管和200 μl、1 ml tip頭若干。

1.3 測(cè)定法（以下操作均為無(wú)菌操作）

1.3.1 方法一[1]①使WISH細(xì)胞在培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，按1∶2～1∶4傳代，每周2～3次，于完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。輕搖WISH細(xì)胞，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS溶液洗2次后加消化液（0.5%胰蛋白酶消化液∶0.02%EDTA=1∶1，即 1.5 ml∶1.5 ml）消化，鏡下觀察消化程度，見鏡下大部分細(xì)胞離散后，吸棄消化液，立即加5 ml 10%DMEM培養(yǎng)液，終止消化反應(yīng)，用10 ml移液管用力吹打?qū)⒓?xì)胞吹散，鏡下觀察大部分細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞，用10%DMEM培養(yǎng)液配成3.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于 96孔培養(yǎng)板中， 每孔 100 μl，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4～6 h。②標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：取1支干擾素活性測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，按使用說(shuō)明書復(fù)溶后，用7%DMEM培養(yǎng)液稀釋至1 000 IU/ml（IFN國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品直接加7%DMEM培養(yǎng)液220 μl稀釋）。在96孔培養(yǎng)板中，以4倍稀釋度做梯度稀釋（50 μl+150 μl），共8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)復(fù)孔。供試品溶液的配制：將供試品按標(biāo)示量復(fù)溶后，用7%DMEM培養(yǎng)液稀釋成約1 000 IU/ml。在96孔培養(yǎng)板中，以4倍稀釋度做梯度稀釋，共8個(gè)稀釋度，每個(gè)梯度做2個(gè)復(fù)孔。③將②項(xiàng)配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液加入接種WISH細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔 100 μl，于 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 18～24 h。 ④制備病毒液與攻毒：取-70℃凍存的VSV用2%DMEM攻毒培養(yǎng)液稀釋至100TCID50。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)板的上清，將稀釋好的病毒液加入培養(yǎng)板中，每孔 100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h。⑤鏡檢標(biāo)準(zhǔn)溶液的50%病變點(diǎn)在1 IU/ml，即為F行。然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入50 μl結(jié)晶紫染色液，室溫放置30 min后，用水盆盛上純化水，換水漂洗培養(yǎng)板3次，并在吸水紙上輕叩幾下，然后每孔加入100 μl脫色液，室溫放置5～10 min。用微量振蕩器振蕩混勻1～2 min，然后于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定。根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。

1.3.2 方法二[1-3]此方法中①～④與方法一中相同。⑤每孔加入 0.5%MTT 溶液 20 μl， 于 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 5 h，然后每孔加入100 μl裂解液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜，用微量振蕩器振蕩混勻1～2 min，然后于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定。根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 方法一測(cè)定結(jié)果

見表1。

表1 方法一測(cè)定結(jié)果（107IU/ml）

方法一總平均值為1.916×107IU/ml，所有測(cè)定值間的RSD為15.0%。

2.2 方法二測(cè)定結(jié)果

見表2。

表2 方法二測(cè)定結(jié)果（107IU/ml）

方法二總平均值為1.887×107IU/ml，所有測(cè)定值間的RSD為11.8%。

2.3 方法一每次測(cè)定的r值

見表3。

表3 方法一每次測(cè)定的r值

2.4 方法二每次測(cè)定的r值

見表4。

表4 方法二每次測(cè)定的r值

3 討論

由表1、2可以看出，兩種方法平均值偏差不大，方法一單次測(cè)定結(jié)果之間偏差較大，r值較小；方法二單次測(cè)定結(jié)果之間偏差較小，r值較大。由此可以看出，方法二測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

實(shí)驗(yàn)所用WISH細(xì)胞株的生長(zhǎng)狀態(tài)、鋪板細(xì)胞數(shù)目、VSV滴度以及病變終止時(shí)間的確定等因素都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尤其是病變終止時(shí)間的確定存在個(gè)人主觀偏差。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的良好重復(fù)性，需要嚴(yán)格保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性。

目前測(cè)定干擾素活性更為靈敏的方法還有ELISA檢測(cè)法和LDH釋放法[4-5]等，更為客觀的方法正在摸索中，希望不久能夠建立更為靈敏的檢測(cè)方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].三部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄56-57,附錄59.

[2]黃志榮.MTT比色法在干擾素生物學(xué)活性測(cè)定中應(yīng)用的探討[J].海峽藥學(xué),2006,18(6):60-61.

[3]伊春德,金伯泉,黃傳書.應(yīng)用MTT法測(cè)定IFN的生物活性效價(jià)[J].上海免疫學(xué)雜志,1999,10(4):247.

[4]程偉,顧瑛,李新元,等.用LDH釋放法判斷細(xì)胞病變程度確定干擾素生物活性[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào),1999,20(4):295-297.

[5]何金生,宗庭益.LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志,1996,8(2):10-13.