葉銀萍， 徐曉虹， 李 濤， 羅清清

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江師范大學(xué) 生態(tài)研究所，浙江 金華 321004)

在脊椎動物的腦結(jié)構(gòu)中，作為潛在記憶庫的海馬是一個(gè)重要的腦區(qū)，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[1].海馬結(jié)構(gòu)的發(fā)育形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)決定其機(jī)能活動，依據(jù)細(xì)胞構(gòu)筑的不同，海馬可分為 CA1,CA2和CA3共3個(gè)區(qū).海馬神經(jīng)元軸突和樹突的生長及突觸聯(lián)系決定了海馬的功能，而神經(jīng)元的功能與其形態(tài)密不可分.研究發(fā)現(xiàn)，海馬錐體神經(jīng)元頂樹突的分支復(fù)雜程度在接受傳入信息過程中起著重要作用，基樹突影響反饋回路的形成，而軸突則決定傳出信息的范圍和廣度[2-3].發(fā)育早期的神經(jīng)元(約出生后1周)樹突樹逐漸發(fā)育成熟，樹突干上具有眾多樹突生長錐和樹突絲，它們活躍地伸縮運(yùn)動，與軸突相接觸并逐漸形成突觸[4-5].2～3周后，樹突絲逐漸被粗短而穩(wěn)定的樹突棘取代，同時(shí)形成大量的興奮性突觸，其主要解剖學(xué)位置位于樹突棘[6-7].傳統(tǒng)的固定染色的形態(tài)學(xué)觀測技術(shù)限制了神經(jīng)元形態(tài)的動態(tài)研究.目前，對海馬神經(jīng)元發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)動態(tài)變化的研究仍然較少.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP)，用于感染體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，結(jié)合活細(xì)胞成像法,清楚地顯現(xiàn)樹突及突起的形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)，以達(dá)到量化分析神經(jīng)元形態(tài)動態(tài)發(fā)育的目的.

1 材料和方法

1.1 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：Neurobasal TM Medium,B27添加劑(Invitrogen),DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco),胰蛋白酶(Amresco),多聚賴氨酸(sigma),優(yōu)級胎牛血清(FBS.杭州四季清)，L-谷氨酰胺(Amresco),青霉素,鏈霉素(Amresco).其他試劑為國產(chǎn)分析純.

包裝腺病毒相關(guān)試劑：腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrackcmv,骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(由美國Johns Hopkins腫瘤研究中心Belt Vogelstein博士惠贈),限制性內(nèi)切酶Pme I,Pac I(NEB),BJ5183菌,Lipofectin 2000(Invitrogen),Promega質(zhì)粒小量提取試劑盒(Promega),胰蛋白胨,酵母提取物(Amresco).

實(shí)驗(yàn)動物：新生24 h內(nèi)的健康SD大鼠乳鼠.成年SD大鼠購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心.

1.2 構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白的病毒

表達(dá)綠色熒光蛋白腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建：用Pme I酶切1 μg pAdtrackcmv質(zhì)粒使其線性化，然后與100 ng腺病毒骨架質(zhì)pAdEasy-1共同電轉(zhuǎn)化(2.5 kV,200 Ω,25 μF)20 μL的 BJ5183感受態(tài)菌.取30 μL菌液涂于含25 μg/mL卡那霉素的LB平板上，20 h后挑選小克隆菌團(tuán)，37 ℃培養(yǎng)過夜，小量提取質(zhì)粒電泳初步判斷重組體后，再經(jīng)Pac I酶切鑒定正確重組的pAd-EGFP腺病毒質(zhì)粒.

原代病毒的制備：按照Promega試劑盒說明書提取重組的質(zhì)粒.當(dāng)生長于25 cm2培養(yǎng)瓶中的293A細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)，按照Lipofectine 2000的說明書，取4 μg經(jīng)Pac I線性化的pAd-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞.轉(zhuǎn)染后2 d在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá).感染7～9 d后收集細(xì)胞，液氮反復(fù)凍融細(xì)胞3次，離心取上清液，再次感染2瓶接種于75 cm2培養(yǎng)瓶的293A細(xì)胞并收集病毒液，重復(fù)2～3次以得到高滴度病毒.

病毒滴度計(jì)算：取10 μL病毒液，1∶10倍稀釋后感染293A細(xì)胞，感染后24 h在熒光顯微鏡下記錄各稀釋度病毒感染細(xì)胞后發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)，按公式

病毒滴度=發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)×稀釋度/病毒液體積

計(jì)算病毒滴度.病毒液中加入10%的甘油并保存于-80 ℃冰箱中.

1.3 大鼠海馬神經(jīng)元離體培養(yǎng)及鑒定

參照文獻(xiàn)[8],取出生24 h內(nèi)的SD仔鼠的大腦，分離出海馬組織，去腦膜，剪碎加入0.125%的胰蛋白酶，消化15 min并用拋光過的小開口滴管反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液.用種植液(含10% FBS,3 g/LL-谷氨酰胺和100 mg/L雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液)稀釋細(xì)胞并接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸(0.1 mg/mL)的小玻片上，細(xì)胞密度(1～2)×104/cm2，每個(gè)直徑35 mm培養(yǎng)皿中約10片小玻片，培養(yǎng)于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中,4～5 h后每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)加2 mL種植液，24 h后用培養(yǎng)液(含2% B27添加劑,3 g/LL-谷氨酰胺和100 mg/L雙抗的Neurobasal培養(yǎng)基)全量換液，之后每隔3 d半量換液.

采用烯醇化酶(NSE)免疫染色法測定體外培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)的純度.取培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)元，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，4%多聚甲醛液固定10 min，3%H2O2溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.1% Triton X-100溶液破膜，滴加正常山羊血清工作液封閉10 min，然后加入兔抗鼠NSE抗體(1∶200)，37 ℃孵育4 h，PBS洗滌3次，加入生物素化二抗(山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，滴加過氧化物酶復(fù)合物溶液37 ℃孵育15 min，PBS洗滌，滴加3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色液顯色15 min，自來水沖洗后封片.光鏡下觀察NSE表達(dá)陽性細(xì)胞.

1.4 腺病毒(Ad-EGFP)感染海馬神經(jīng)元

體外培養(yǎng)第5天的大鼠海馬神經(jīng)元，每個(gè)培養(yǎng)皿(培養(yǎng)液2 mL)加入4 μL腺病毒(Ad-EGFP)，十字型緩慢搖勻，6 h后全量換液，感染48 h后觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)[9].0.4%臺盼藍(lán)溶液檢測腺病毒感染48 h后神經(jīng)元的存活率.

1.5 活細(xì)胞成像與定量分析

對體外培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)元(感染后48 h)進(jìn)行成像時(shí)，用倒置熒光顯微鏡的40倍物鏡，每隔2 min對同一視野下的神經(jīng)元進(jìn)行成像，11張照片為1組，疊加后可動態(tài)觀察樹突的發(fā)育.根據(jù)形態(tài)學(xué)分類，把樹突干上長度為2～10 μm具有指狀尖端的突起定義為樹突絲.挑選形態(tài)健康的海馬神經(jīng)元手工描繪所有樹突絲，用Image-pro Plus 5.0測量隨機(jī)選取的10段樹突絲的長度，將每2張照片的樹突絲長度之差的絕對值相加，表示單個(gè)細(xì)胞樣品樹突絲的變化值.樹突絲的運(yùn)動性用20 min內(nèi)樹突絲長度變化總值的平均值表示，單位為μm.用每100 μm樹突干上樹突絲的平均數(shù)目定義樹突絲的密度.測量所有樹突分支的長度，計(jì)算樹突分支的總長度.計(jì)數(shù)樣本來自3個(gè)不同批次培養(yǎng)的神經(jīng)元，每批次選取6～8個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，約測量100個(gè)樹突絲.

M:1 kb Marker;1:腺病毒重組體(pAd-EGFP)

2 結(jié) 果

2.1 pAd-EGFP腺病毒載體的鑒定

pAdtractcmv和pAdEasy-1電轉(zhuǎn)化后，對腺病毒同源重組體用Pac I酶切分析，陽性重組體除有一約33 kb的大片段外，還應(yīng)釋放出一4.5 kb的特異性小片段，酶切結(jié)果與預(yù)期33 kb和4.5 kb的2條片段相符(見圖1).

2.2 重組腺病毒原代包裝過程的觀察

將線性化的pAd-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293A細(xì)胞后在該細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行包裝.感染2,5,7 d后的海馬神經(jīng)細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，熒光下可見彗星樣病毒特征性噬斑形成(見圖2)，說明腺病毒包裝成功.

2.3 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元形態(tài)的觀察

倒置顯微鏡下觀察：剛分離的海馬神經(jīng)元小而圓；培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞貼壁良好，生長旺盛，并形成1～2個(gè)細(xì)而短的突起；培養(yǎng)第7天，海馬神經(jīng)元的胞體豐滿(10～20 μm),突起進(jìn)一步增多、延長，并交織形成網(wǎng)絡(luò)(見圖3).活性較好的海馬神經(jīng)元胞體呈錐形或橢圓形，細(xì)胞膜完整、清晰，有折光性，立體感較強(qiáng)；活性較差的海馬神經(jīng)元通常胞膜不清晰，立體感較差，突起斷裂或呈串珠狀，胞質(zhì)中?？梢娒黠@的核仁，有些神經(jīng)元為圓形，無突起，說明細(xì)胞受損傷較嚴(yán)重.烯醇化酶(NSE)免疫染色結(jié)果顯示培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)元純度可達(dá)95%.

A：2 d；B：5 d；C：7 d(200×)

圖3 培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)元(200×)

2.4 Ad-EGFP感染海馬神經(jīng)元的細(xì)胞成像

腺病毒感染48 h后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，結(jié)果表明神經(jīng)元的存活率約為92%.由此表明該方法對神經(jīng)元細(xì)胞無明顯毒性，可用于神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的研究.倒置熒光顯微鏡下對腺病毒感染48 h后的神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞成像，海馬神經(jīng)元全細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(見圖4中A)，清晰顯示其全細(xì)胞形態(tài)，且感染率可達(dá)30%～50%.該技術(shù)結(jié)合活細(xì)胞成像可顯現(xiàn)樹突絲的運(yùn)動性(見圖4中B).圖4中箭頭標(biāo)注為生長變化較為明顯的樹突絲.量化分析結(jié)果顯示20 min內(nèi)體外培養(yǎng)第7天的海馬神經(jīng)元樹突絲運(yùn)動的絕對平均值為3.47 μm(樹突絲運(yùn)動性：20 min (3.47±0.004) μm)；每100 μm樹突干上的樹突絲數(shù)目為9.7個(gè)(樹突絲密度：9.7±0.36).

A:海馬神經(jīng)元全細(xì)胞形態(tài);B:活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像顯現(xiàn)樹突絲的生長動態(tài).Scale bar:4 μm

3 討 論

腺病毒載體是目前廣泛應(yīng)用的基因運(yùn)載系統(tǒng)，它可以高效地將目的基因直接轉(zhuǎn)入哺乳動物的細(xì)胞或組織中，并且具有宿主范圍廣泛、可感染增殖和非增殖細(xì)胞、易于制備等優(yōu)點(diǎn)[9].E1區(qū)缺失的腺病毒只能在整合E1區(qū)的HEK293等少數(shù)細(xì)胞中復(fù)制，因此,采用包裝好的復(fù)制缺陷型重組腺病毒可在其他宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因而自身不復(fù)制，從而減少了對宿主細(xì)胞的傷害而作為基因表達(dá)的優(yōu)良載體[10].本實(shí)驗(yàn)選用pAdtrackcmv作為穿梭載體，此載體內(nèi)含表達(dá)綠色熒光蛋白的啟動子，綠色熒光蛋白的表達(dá)使轉(zhuǎn)染結(jié)果的判斷以及滴度測定更加容易，若插入目的基因則可作為報(bào)告基因判斷目的蛋白的表達(dá)[11].本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的腺病毒(Ad- EGFP)感染宿主細(xì)胞后只表達(dá)綠色熒光蛋白，可用于各種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究.

神經(jīng)元樹突的主要功能是接受和整合突觸傳入信息，其接受的突觸傳入信息種類很多，既有興奮性的，也有抑制性的；既有可產(chǎn)生電效應(yīng)的，亦有可產(chǎn)生生物化學(xué)效應(yīng)的.樹突分支結(jié)構(gòu)和生物物理特性決定了突觸輸入和輸出的過程.腦發(fā)育早期，神經(jīng)元樹突干上出現(xiàn)許多未成熟的絲狀突起，稱為樹突絲.隨著神經(jīng)元的發(fā)育，樹突干上的樹突絲減少，而樹突棘出現(xiàn).樹突絲的發(fā)育過程被認(rèn)為參與了樹突分支形成、樹突棘發(fā)育和突觸形成[4].在突觸發(fā)生階段，樹突表現(xiàn)出高度的運(yùn)動性，隨著突觸的形成，樹突絲的密度下降而樹突棘密度增加[12-13].因而人們普遍認(rèn)為樹突絲是樹突棘的前體.這種觀點(diǎn)在近年的實(shí)驗(yàn)中逐漸得到了證實(shí)[6-7,14]，即隨著發(fā)育的進(jìn)行，樹突絲逐漸被粗短而穩(wěn)定的樹突棘取代.樹突發(fā)育過程的分支動力學(xué)特征高度動態(tài)變化，對環(huán)境因素也非常敏感，傳入纖維支配、功能刺激、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等均可影響樹突的生長發(fā)育，因此,研究樹突形態(tài)的動態(tài)變化對闡明神經(jīng)元的發(fā)育及各種因素的影響機(jī)制具有重要意義.傳統(tǒng)的通過固定細(xì)胞后染色研究海馬神經(jīng)元形態(tài)的方法，如：Dil染色、MAP2染色、Golgi染色法在分析樹突樹和樹突棘中也有廣泛的應(yīng)用[15-17]，但這些方法的缺點(diǎn)是不能體現(xiàn)樹突的動態(tài)生長過程.而綠熒光蛋白表達(dá)的海馬神經(jīng)元活細(xì)胞成像和量化分析技術(shù)是神經(jīng)元形態(tài)動態(tài)研究的有效方法[18-19].

海馬神經(jīng)元是最難轉(zhuǎn)染DNA的細(xì)胞類群之一，原因在于它們對微環(huán)境的變化非常敏感,并且感染后細(xì)胞非常容易死亡.近年來采用較多的磷酸鈣法和脂質(zhì)體法將GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入神經(jīng)元[20-22]，使其表達(dá)綠色熒光蛋白，但這2種方法普遍存在轉(zhuǎn)染效率偏低、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞受損較嚴(yán)重和細(xì)胞凋亡等問題.采用腺病毒感染海馬神經(jīng)元可以克服GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的缺點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:腺病毒能有效感染海馬神經(jīng)元，感染率可達(dá)30%～50%，可清晰顯現(xiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白海馬神經(jīng)元的全部形態(tài)細(xì)節(jié)，包括細(xì)微結(jié)構(gòu)如樹突絲、樹突棘,結(jié)合活細(xì)胞成像和量化分析技術(shù)即可用于具有高度運(yùn)動性的樹突絲的長度、運(yùn)動性、密度等指標(biāo)的測量[23]，從而達(dá)到動態(tài)觀察神經(jīng)元樹突生長發(fā)育的目的.同時(shí)，感染腺病毒對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元無明顯毒性作用，細(xì)胞生長狀況良好；包裝出來的病毒適宜保存，應(yīng)用方便，經(jīng)濟(jì)而高效.當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了它在應(yīng)用過程中存在的缺陷：形態(tài)學(xué)觀察受到熒光蛋白表達(dá)時(shí)間和強(qiáng)度的限制.本研究發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白可持續(xù)表達(dá)3～5 d，感染后48 h是觀察的最佳時(shí)間.此外，普通熒光顯微鏡成像所得圖像存在清晰度欠佳和分辨率、放大率不夠高等問題.運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡成像可獲得比普通熒光顯微鏡更高對比度、清晰度和分辨率的圖像，并且具有實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒馔瑫r(shí)觀察及形成清晰的三維圖像等優(yōu)點(diǎn).這些優(yōu)勢為腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)綠色熒光蛋白進(jìn)行神經(jīng)元形態(tài)學(xué)研究提供了更為精確、可靠的成像技術(shù)，為該實(shí)驗(yàn)方法的廣泛運(yùn)用提供了可能性.

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP)，并有效地感染了原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元.該方法與活細(xì)胞成像、量化分析技術(shù)相結(jié)合能夠有效地應(yīng)用于神經(jīng)元發(fā)育的動態(tài)研究，為發(fā)育中神經(jīng)元樹突生長的形態(tài)變化及各種環(huán)境因素和化學(xué)物質(zhì)對神經(jīng)元生長發(fā)育影響的研究，提供了一種簡便、經(jīng)濟(jì)而有效的方法.

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