王振華，劉云會(huì)，薛一雪

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1；2.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 1 1 0 0 0 4；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

近年來，腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類疾病的基因治療中。它具有安全性較好且轉(zhuǎn)染率高等優(yōu)點(diǎn)，但其應(yīng)用在某些科學(xué)領(lǐng)域也存在一定的局限性，例如體外轉(zhuǎn)染腺病毒載體可干擾原代培養(yǎng)的某類細(xì)胞的一些特定功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，表達(dá)β半乳糖苷酶（βgal）基因的腺病毒載體以20 MOI的劑量轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的垂體前葉細(xì)胞，將影響該細(xì)胞激素的分泌及細(xì)胞增殖［1］。在原代培養(yǎng)的牛腎上腺皮質(zhì)等細(xì)胞中，攜帶某種基因的腺病毒載體也會(huì)不同程度地改變這些細(xì)胞分泌激素等功能［2］。盡管腺病毒載體已成功用于在體或離體培養(yǎng)的內(nèi)分泌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，尤其是垂體前葉細(xì)胞［3，4］，但鮮有在內(nèi)分泌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染腺病毒載體效應(yīng)的報(bào)道。如果腺病毒載體本身對(duì)靶細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，將使腺病毒載體的應(yīng)用嚴(yán)重受限。因此，了解腺病毒載體和靶細(xì)胞的相互作用對(duì)于腺病毒載體的成功應(yīng)用具有重要意義。本研究觀察腺病毒載體對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠垂體催乳素細(xì)胞增殖功能的影響，并進(jìn)一步探討其可能的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

7周齡雌性Wistar ST大鼠126只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。腺病毒表達(dá)質(zhì)粒，購(gòu)自Clontech公司；磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding pro－tein，pCREB）抗體，購(gòu)自 Cell Signaling公司；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體，購(gòu)自O(shè)ncogene公司。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒載體制備：腺病毒載體（Ad-prl/βgal、Ad-CMV/empty、Ad-CRE/Luc）的制備參照Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)說明書（Clontech Laboratories，Mountain View，USA）和參考文獻(xiàn)［5］完成。

1.2.2 垂體前葉細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：Wistar ST大鼠用乙醚麻醉后斷頭，無菌條件下開顱取出垂體，去除后葉。將垂體前葉置于S-MBH的培養(yǎng)皿中，用眼科剪把前葉組織切成細(xì)小的碎片，用0.1%的胰蛋白酶消化，37℃振蕩水浴40 min，用吸管吹打細(xì)胞后終止消化，細(xì)胞懸液經(jīng)1 100 r/min離心10 min，棄掉上清，滴加DMEM/F12培養(yǎng)液，使垂體前葉細(xì)胞再懸浮分散。鏡檢計(jì)數(shù)后，將100 μl的2×106/ml細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸處理的35 mm培養(yǎng)皿中，以垂體前葉細(xì)胞培養(yǎng)皿為觀察單位，隨機(jī)分為對(duì)照組（細(xì)胞未轉(zhuǎn)染腺病毒載體）、Ad-βgal轉(zhuǎn)染組和Ad-empty轉(zhuǎn)染組（未攜帶外源性基因的空腺病毒載體，腺病毒載體劑量為5 MOI）3組，每組8個(gè)皿。腺病毒載體轉(zhuǎn)染組先加入合適劑量的腺病毒載體于細(xì)胞懸液中混勻后，再滴入培養(yǎng)皿中，而后置于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 X-gal組化方法鑒定腺病毒載體轉(zhuǎn)染的效果：腺病毒載體感染垂體細(xì)胞72 h，3%多聚甲醛固定10 min，PBS洗5 min，含1%Tween20的TBS孵育30 min，加入 X-gal染色液（1 mg/ml X-gal、5 mmol/L鐵氰酸三鉀、5 mmol/L鐵氰酸四鉀、2 mmol/L氯化鎂溶于PBS），37℃孵育1 h，封片。計(jì)數(shù)腺病毒感染的藍(lán)染陽性細(xì)胞率。

1.2.4 5-溴-2′-脫氧尿苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine，BrdU）標(biāo)記法檢測(cè)轉(zhuǎn)染腺病毒載體后的大鼠垂體催乳素細(xì)胞的增殖功能：細(xì)胞培養(yǎng)第3天，對(duì)照組、Adβgal轉(zhuǎn)染組和Ad-empty轉(zhuǎn)染組均給予200 μmol/L BrdU，培養(yǎng)3 h，終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用冰甲醇固定，然后用BrdU抗體和催乳素（prolactin，PRL）抗體做雙重免疫細(xì)胞熒光染色［6］，封片后用熒光顯微鏡觀察并照相，每個(gè)玻片隨機(jī)選擇1 000個(gè)PRL免疫陽性細(xì)胞，計(jì)算BrdU標(biāo)記指數(shù)，即PRL和BrdU均陽性的細(xì)胞占PRL陽性細(xì)胞的百分比。BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞呈紅色熒光，定位于胞核。所用抗體如下：兔抗大鼠 PRL一抗（NIDDK IC-5，1∶4 000）/FITC標(biāo)記的抗兔IgG（Amersham公司，1∶50）；小鼠多克隆抗 BrdU（Sigma 公司，1∶200）/生物素化抗小鼠IgG（Vector公司，1∶50）/Texas Red抗鏈霉素蛋白（Amersham 公司，1∶50）。

1.2.5 免疫熒光方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染腺病毒載體的催乳素細(xì)胞中pCREB蛋白的表達(dá)：催乳素細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染腺病毒載體（vehicle）組、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）組、Ad-empty 轉(zhuǎn)染組、Adempty+IGF-1 組、Ad-βgal轉(zhuǎn)染組和 Ad-βgal+IGF-1組。IGF-1處理組為細(xì)胞培養(yǎng)第3天加入30 ng/ml IGF-1培養(yǎng)3 h，然后用2%多聚甲醛固定細(xì)胞，含1%Tween20的TBS孵育細(xì)胞30 min后，3%H2O2孵育細(xì)胞10 min，封閉緩沖液封閉30 min后，用pCREB（Ser133）抗體和PRL抗體做雙重免疫細(xì)胞熒光染色［7］，用Photoshop軟件定量分析胞核內(nèi)FITC的熒光強(qiáng)度，計(jì)算各組PRL免疫陽性細(xì)胞中pCREB蛋白陽性表達(dá)率。所用抗體如下：?jiǎn)慰寺⊥每?pCREB 一抗（1∶100），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗兔IgG（1∶100），辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗FITC抗體（1∶200），Tyramide-FITC（1∶50），小鼠抗 PRL 抗體（1∶30 000），Alexa Fluor 594 標(biāo)記抗小鼠 IgG（1∶100）。1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染腺病毒載體的催乳素細(xì)胞中cAMP反應(yīng)元件（cAMP response element，CRE）基因的表達(dá)：每組在制備細(xì)胞懸液時(shí)，分別加入0.5 MOI的Ad-CRE/Luc。垂體細(xì)胞培養(yǎng)第3 天，用 400 μl裂解液（Promega）裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞，4℃、15 000 r/min離心2 min，采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組中CRE元件熒光的表達(dá)水平，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以每組熒光強(qiáng)度倍數(shù)來反映各組細(xì)胞中CRE的熒光表達(dá)活性。

1.2.7 Western blot方法檢測(cè)腺病毒載體對(duì)垂體前葉細(xì)胞中PCNA表達(dá)的影響：各組分別接種濃度為3.0×106/ml的大鼠垂體前葉細(xì)胞懸液300 μl于35 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入100 μl裂解液，15 min后收集細(xì)胞，4℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取各組的等量蛋白在12.5%SDS-PAGE中電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h后，在1∶1 000稀釋的單克隆小鼠抗PCNA抗體中4℃孵育過夜，經(jīng)TBS充分洗膜后，室溫下與1∶8 000稀釋的二抗結(jié)合 1 h，ECL 法顯色。以 β-actin（1∶10 000）為內(nèi)對(duì)照，所得圖像用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)得整合光密度值（integrated density value，IDV）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒載體轉(zhuǎn)染垂體前葉細(xì)胞效率的鑒定

X-gal染色結(jié)果顯示，Ad-βgal轉(zhuǎn)染組垂體前葉細(xì)胞藍(lán)染，經(jīng)KS400圖像分析系統(tǒng)計(jì)算，報(bào)告基因βgal經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)移到垂體前葉細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率為（55.9±2.3）%。見圖 1。

2.2 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對(duì)催乳素細(xì)胞增殖功能的影響

BrdU和PRL雙重免疫熒光結(jié)果顯示，催乳素細(xì)胞陽性細(xì)胞呈綠色熒光，定位于胞質(zhì)；胞質(zhì)呈綠色、胞核呈紅色的細(xì)胞為BrdU標(biāo)記陽性的催乳素細(xì)胞，垂體前葉細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-empty或Ad-βgal后顯著增加催乳素細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖（P<0.01）。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對(duì)催乳素細(xì)胞CRE元件表達(dá)的影響

CREB蛋白可與CRE元件特異性結(jié)合，發(fā)揮重要的核轉(zhuǎn)錄因子的作用。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Ad-empty或Ad-βgal的垂體細(xì)胞CRE元件的表達(dá)活性顯著增高（P<0.01）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對(duì)催乳素細(xì)胞pCREB蛋白表達(dá)的影響

pCREB和PRL雙重免疫熒光結(jié)果顯示，催乳素細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色熒光染色，pCREB陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈綠色熒光染色。胞質(zhì)呈紅色、胞核呈綠色的細(xì)胞為pCREB表達(dá)免疫陽性的催乳素細(xì)胞。與 IGF-1組相比，Ad-empty+IGF-1組和 Ad-βgal+IGF-1組催乳素細(xì)胞pCREB的表達(dá)活性顯著增加（P<0.01）。Ad-empty 轉(zhuǎn)染組和 Ad-βgal轉(zhuǎn)染組pCREB的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)染腺病毒載體組（P<0.01）。見圖 4。

2.5 轉(zhuǎn)染腺病毒載體對(duì)垂體前葉細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

PCNA是一種相對(duì)分子量為36 kDa的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Ad-empty轉(zhuǎn)染組和Ad-βgal轉(zhuǎn)染組垂體細(xì)胞內(nèi)PCNA蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，其條帶IDV值顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。見圖5。

3 討論

在基因治療和免疫療法中，腺病毒載體由于其轉(zhuǎn)基因效率高，且容易獲得高滴度和純度的載體，愈來愈受到研究者們的重視。催乳素增高的垂體瘤是內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見疾病，深入研究導(dǎo)致催乳素細(xì)胞異常增殖的影響因素對(duì)于探究垂體瘤的病因及發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細(xì)胞為模型，深入探討了腺病毒載體對(duì)催乳素細(xì)胞增殖功能的影響及可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)βgal基因的腺病毒載體及未攜帶外源性基因的空腺病毒載體均明顯增強(qiáng)催乳素細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖，提示腺病毒載體本身即可改變催乳素細(xì)胞的增殖功能，而且垂體前葉細(xì)胞在感染以上2種腺病毒載體后，細(xì)胞內(nèi)CRE的活性及pCREB蛋白、PCNA蛋白的表達(dá)較對(duì)照組亦明顯增高。

CRE元件是一段約30 bp構(gòu)成的DNA片段，這段序列主要存在于許多靶基因的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子上，而CREB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，被磷酸化激活以后可選擇性結(jié)合CRE，刺激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。CREB可被諸多蛋白激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，其作用非常廣泛，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、存活，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等［8，9］。有實(shí)驗(yàn)證明，CREB 磷酸化以后在維持原代培養(yǎng)的催乳素細(xì)胞增殖功能中起重要的調(diào)節(jié)作用，下調(diào)CREB基因表達(dá)或抑制CRE轉(zhuǎn)錄活性可降低催乳素細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖［7］。本研究采用熒光素酶報(bào)告基因和定量雙重免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)垂體前葉細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組腺病毒載體后，可顯著增強(qiáng)CRE的活性和pCREB的表達(dá)，因此我們推測(cè)CREB可能參與了腺病毒載體對(duì)催乳素細(xì)胞增殖功能的改變。

CREB調(diào)節(jié)的下游靶基因中包括許多與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如 c-fos、cyclins A、cyclins D、PCNA等，CREB被激活后可能通過上調(diào)這些基因的表達(dá)來刺激細(xì)胞的增殖［7，10，11］。PCNA 是一種細(xì)胞核內(nèi)合成的分子量為36 kDa的蛋白質(zhì)，其功能與DNA合成密切相關(guān)。檢測(cè)細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平可較好地反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，尤其是對(duì)研究某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定價(jià)值。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PCNA可反映垂體腺瘤細(xì)胞的增殖活性。在本研究的Western blot結(jié)果中，垂體前葉轉(zhuǎn)染腺病毒載體后，細(xì)胞內(nèi)PCNA的表達(dá)亦顯著增強(qiáng)，與pCREB的表達(dá)變化一致。在本研究中PCNA的表達(dá)增加是否是因?yàn)閜CREB上調(diào)所致尚需進(jìn)一步證明。

綜上所述，本研究表明雖然重組腺病毒載體可以被有效地應(yīng)用于垂體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染中，但本身也會(huì)通過上調(diào)pCREB、PCNA蛋白的表達(dá)，在一定程度上改變催乳素細(xì)胞的增殖狀態(tài)，這一結(jié)果為闡明腺病毒載體和內(nèi)分泌細(xì)胞之間的相互作用及指導(dǎo)腺病毒載體的成功應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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