楊 萍,蔡本利,洪鵬志

水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088

金槍魚(yú)是遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),作為一種深海魚(yú)類(lèi),金槍魚(yú)肉質(zhì)鮮美,營(yíng)養(yǎng)全面,是現(xiàn)代人喜愛(ài)的美食。研究表明,金槍魚(yú)保健功能顯著,具有防止動(dòng)脈硬化,保護(hù)肝臟、治療貧血多方面的功效[1],其加工產(chǎn)品附加值非常高。目前,金槍魚(yú)除少部分冰鮮銷(xiāo)售外,一般都經(jīng)冷凍制成冷凍金槍魚(yú)肉,通常都用來(lái)制成魚(yú)生、壽司、調(diào)味或罐裝食品。金槍魚(yú)加工過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量的下腳料,包括魚(yú)頭、內(nèi)臟、鰓、魚(yú)皮等,產(chǎn)生的下腳料大約占總重量的 50% ～70%,下腳料中含有大量的蛋白質(zhì),脂肪、礦物質(zhì)及多種生物活性物質(zhì),是值得開(kāi)發(fā)利用的資源。海洋生物是研究開(kāi)發(fā)功能性活性物質(zhì)的良好資源。目前,海洋生物中免疫活性物質(zhì)的研究主要集中在貝類(lèi),有牡蠣提取物[2]、扇貝多肽[3]、文蛤提取物[4]、鮑魚(yú)酶解提取物[5]等,海洋魚(yú)類(lèi)來(lái)源的免疫活性物質(zhì)的研究少見(jiàn)有報(bào)道。我們對(duì)金槍魚(yú)屬中產(chǎn)量最大的黃鰭金槍魚(yú)(Thunnus albacares)魚(yú)頭的營(yíng)養(yǎng)成分[6]進(jìn)行了研究,報(bào)道了其蛋白酶解液對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[7],本文報(bào)道黃鰭金槍魚(yú)頭蛋白酶解液及其超濾組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響,旨在探討金槍魚(yú)頭蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性,為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí) Balb/c種小鼠(合格證編號(hào):0016240),雄性,19～21 g,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;黃鰭金槍魚(yú)頭,由廣東省廣遠(yuǎn)遠(yuǎn)洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司提供(冰柜中冷凍保存);木瓜蛋白酶、中性蛋白酶,購(gòu)自廣西南寧龐博生物有限公司;RPMI1640培養(yǎng)液,購(gòu)自北京天潤(rùn)善達(dá)生物科技有限公司;青霉素/鏈霉素(10000 IU/mL),購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所;新生牛血清,購(gòu)自杭州四季清生物技術(shù)公司產(chǎn)品;MTT,Duchefa產(chǎn)品;刀豆蛋白 A(ConA),Calbiochem產(chǎn)品;二甲基亞砜 (DMSO)、脂多糖(LPS)購(gòu)自 sigma公司;杯式超濾器購(gòu)自上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司,酶標(biāo)儀為 Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 黃鰭金槍魚(yú)頭蛋白酶解液及分級(jí)組分的制備

金槍魚(yú)頭熱水浸提后取肉,絞碎,勻漿,按文獻(xiàn)[8]條件進(jìn)行酶解,100℃水浴滅酶 10min,冷卻后,以 4000 r/m in離心 10 min,棄去上層油脂、雜質(zhì)和下層沉淀,中間清液即為金槍魚(yú)頭蛋白酶解液EPTH(以下簡(jiǎn)稱(chēng)酶解液),酶解液在 0.25 MP壓力下,先后經(jīng)過(guò)截留分子質(zhì)量為 10、5、3、1 kD的平板膜進(jìn)行超濾,得到分子量為 10 kD以上、10～5 kD、5～3 kD、3～1 kD、1 kD以下五級(jí)組分,將五級(jí)組分的蛋白質(zhì)含量調(diào)整與酶解液的濃度一致,于 121℃高溫滅菌后,分別標(biāo)記為組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,冷藏備用。

1.2.2 淋巴細(xì)胞的制備

拉頸處死 Balb/c小鼠,無(wú)菌取脾,剪碎研磨后,于 200目篩網(wǎng)上 Hank's沖洗過(guò)濾,制成細(xì)胞懸液。無(wú)菌條件下 1000 r/min離心 5m in,棄上清,加入 2 m L紅細(xì)胞裂解液,靜止 5 min裂解紅細(xì)胞,1000 r/min離心 5min,棄上清。Hank's液沖洗脾細(xì)胞,離心后棄上清,重復(fù) 1次,2 mLRPMI1640完全培養(yǎng)液重懸脾細(xì)胞,臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù),調(diào)整其濃度為 4×109/L,活細(xì)胞數(shù) ＞95%。

1.2.3 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[9]

無(wú)菌條件下,向 96孔板中依次加入上述脾細(xì)胞懸液 100μL,各組對(duì)照孔加完全培養(yǎng)液 4μL,試驗(yàn)孔加受試樣品 4μL;ConA處理組加 ConA(100mg/L)10μL/孔,LPS處理組加 LPS(200 g/L)10μL/孔,用完全培養(yǎng)液補(bǔ)足每孔體積為 200μL,脾細(xì)胞終濃度為 2×109/L。每個(gè)處理設(shè) 6個(gè)復(fù)孔,置于 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h,培養(yǎng)結(jié)束前 4 h,每孔加無(wú)菌 MTT(5 g/L)溶液 25μL,振蕩均勻。培養(yǎng)結(jié)束后,4000 r/m in離心 5 min,棄上清,每孔加 200μL DMSO終止反應(yīng),振蕩均勻,顯色 10 min,用酶標(biāo)儀在 570 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔的吸光值(A值),以刺激指數(shù)(SI=試驗(yàn)孔 A值 /對(duì)照孔 A值)判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。

1.2.4 EPTH及分級(jí)組分的氮含量的測(cè)定

氮含量:半微量凱氏定氮法[10],蛋白質(zhì)含量 =總氮 ×6.25

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所得數(shù)據(jù)用 Spss13.0軟件處理,結(jié)果以 ±s表示,用 LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 EPTH及分級(jí)組分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

2.1.1 無(wú)有絲分裂原刺激條件下,EPTH及分級(jí)組分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表 1可見(jiàn),在無(wú)有絲分裂原刺激條件下,與對(duì)照組相比,組分Ⅵ(酶解液)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著的促進(jìn)或抑制作用,組分Ⅱ和組分Ⅴ能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性,并且組分Ⅴ的SI達(dá)到 1.93,能非常顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,與組分Ⅱ相比,差異性極顯著(P＜0.001),其余 3組分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用,但無(wú)顯著性。

2.1.2 Con A刺激條件下,EPTH及分級(jí)組分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

由表 1可見(jiàn),與對(duì)照組相比,組分Ⅵ對(duì)由 Con A誘導(dǎo)的 T淋巴細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用,但無(wú)顯著性;組分Ⅱ和組分Ⅴ對(duì)由 ConA誘導(dǎo)的 T淋巴細(xì)胞增殖有極顯著的促進(jìn)作用,而且組分Ⅴ的促進(jìn)作用更加顯著,與組分Ⅱ相比,差異極其顯著(P＜0.001)。其他組分對(duì) Con A誘導(dǎo)的 T淋巴細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用,但無(wú)顯著性。

2.1.3 LPS刺激條件下,EPTH及分級(jí)組分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

由表 1可見(jiàn),與對(duì)照組相比,EPTH及分級(jí)組分的 SI均大于 1,說(shuō)明均有一定的促進(jìn) LPS誘導(dǎo)的 B淋巴細(xì)胞增殖的活性,其中,組分Ⅱ和組分Ⅴ對(duì) LPS誘導(dǎo)的 B淋巴細(xì)胞增殖有極顯著的促進(jìn)作用,而且組分Ⅴ的促進(jìn)作用更加顯著,與組分Ⅱ相比,差異極其顯著(P＜0.001)。EPTH與其余 3組分均無(wú)顯著性。

表 1 EPTH及分級(jí)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響±s,n=6)Table 1 Effects of EPTH and its portions onmouse spleen lymphocyte proliferation±s,n=6)

表 1 EPTH及分級(jí)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響±s,n=6)Table 1 Effects of EPTH and its portions onmouse spleen lymphocyte proliferation±s,n=6)

注:任意兩組間,不含相同小寫(xiě)字母,a、b、c:P＜0.05;不含相同大寫(xiě)字母,A、B、C:P＜0.01;不含相同字母,E、F、M:P＜0.001。 Note:Between any two groups:a,b,c:P＜0.05;A,B,C:P＜0.01;E,F,M:P＜0.001.

組別Group ConA(-)LPS(-) ConA(+) LPS(+)對(duì)照 0.2574±0.0135cFM 0.2868±0.0333cCM 0.2743±0.0217BM組分Ⅰ 0.2433±0.0182cFM(SI=0.95) 0.2432±0.0154dDM(SI=0.85) 0.2990±0.0161BFM(SI=1.09)組分Ⅱ 0.2974±0.0556bF(SI=1.16) 0.3478±0.0189bBF(SI=1.21) 0.3456±0.0173AEF(SI=1.26)組分Ⅲ 0.2196±0.0131cM(SI=0.85) 0.2478±0.0150dCDM(SI=0.86) 0.2935±0.0297BM(SI=1.07)組分Ⅳ 0.2220±0.0188cM(SI=0.86) 0.2632±0.0190cdCDM(SI=0.92) 0.2770±0.0158BM(SI=1.01)組分Ⅴ 0.4962±0.0419aE(SI=1.93) 0.5050±0.0321aAE(SI=1.73) 0.3730±0.0093AE(SI=1.36)組分Ⅵ 0.2585±0.0161bcFM(SI=1.00) 0.2654±0.0162cdCDM(SI=0.93) 0.2853±0.0052BM(SI=1.04)

2.2 EPTH及分級(jí)組分的蛋白質(zhì)含量

酶解液及分級(jí)組分的蛋白質(zhì)含量結(jié)果如表 2所示,隨著截留分子質(zhì)量的降低,各分級(jí)組分的蛋白質(zhì)含量降低;EPTH主要由 10KD以上(組分Ⅰ)和 10～5 kD(組分Ⅱ)的多肽組成,分別占 38.21%、38.9%,1 kD以下(組分Ⅴ)的小肽只占 5.39%。

表 2 EPTH及分級(jí)組分的蛋白質(zhì)含量Table 2 Contentof protein of EPTH and its portions

3 結(jié)果與討論

脾臟是周?chē)馨推鞴?內(nèi)有大量的 T、B淋巴細(xì)胞,是產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的部位,有絲分裂原ConA和 LPS能分別激活 T、B細(xì)胞,促進(jìn) T、B細(xì)胞增殖,機(jī)體淋巴細(xì)胞在受到非特異性抗原刺激后,細(xì)胞增殖分化,發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱.我們的結(jié)果顯示,組分Ⅱ(10～5 kD)和組分Ⅴ(1 kD以下)均是促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用最顯著的組分,不僅本身具有有絲分裂原活性,單獨(dú)作用即能明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,而且還能與有絲分裂 LPS、ConA協(xié)同促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,從而提高機(jī)體免疫力的能力,組分Ⅴ比組分Ⅱ顯示出更強(qiáng)的促進(jìn)作用(P＜0.001);酶解液及其余 3組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均沒(méi)有顯著的促進(jìn)或抑制作用。說(shuō)明組分Ⅱ和組分Ⅴ富集了促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的因子。

膜分離方法用于蛋白及肽的分離在近年來(lái)取得了很大進(jìn)展,Paule等[11]采用納濾膜處理 β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解產(chǎn)物來(lái)除去其中的肽聚集體,使需要的肽得到富集,膜分離操作在免疫活性大豆肽研究開(kāi)發(fā)過(guò)程中具有應(yīng)用價(jià)值[12]。黃鰭金槍魚(yú)頭蛋白經(jīng)酶解所得酶解液并沒(méi)有顯著的促進(jìn)或抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用,經(jīng)超濾分離所得的組分Ⅱ和組分Ⅴ單獨(dú)作用及與 LPS、ConA協(xié)同作用均能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,可能是酶解顯露了具有免疫促進(jìn)作用的肽段,推測(cè)酶解液存在相互抗秸的因子,因而酶解液沒(méi)有顯示出促進(jìn)或抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用,而超濾分離使組分Ⅱ和組分Ⅴ富集了促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的因子。本文結(jié)果為黃鰭金槍魚(yú)頭蛋白酶解液進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用研究提供了參考。

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