邵元龍,董 英

江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013

芝麻作為一種貴重的油料作物,木脂素類化合物是其特征成分,在芝麻中含量為 0.5% ～1.0%[1]。酚類木脂素是重要的組成部分,含量約0.3%～0.5%,主要有為:芝麻素、芝麻素酚、芝麻林素、芝麻林素酚、芝麻酚。最新的研究表明,在制油過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品芝麻餅粕中仍然含有一定量的芝麻木脂素類化合物[2],近年來(lái),有關(guān)芝麻木脂素的分離純化、流向、以及生理功能研究取得了較大的進(jìn)展[3],如對(duì)芝麻素[4,5]、芝麻酚[6]、芝麻素酚[7]等的研究。

應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)方法尋找新抗氧化劑的途徑前景廣闊,2007年,董英[8]用醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕,發(fā)現(xiàn)可以提高其抗氧化活性,而對(duì)發(fā)酵后木脂素的提取條件和發(fā)酵組分變化并未深入探討。為此,本文仍選用該菌株對(duì)芝麻餅粕進(jìn)行發(fā)酵,以抗氧化活性為指標(biāo),對(duì)提取條件再優(yōu)化。并對(duì)發(fā)酵后產(chǎn)生的新物質(zhì)進(jìn)行了分離和鑒別,為進(jìn)一步開發(fā)利用芝麻餅粕奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

菌株:醬油曲霉(Aspergillus sojae),CICC 2128:購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;芝麻餅粕由江蘇鎮(zhèn)江京友調(diào)味品公司提供;二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

JJ-1型電動(dòng)攪拌器:江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;LD5-10離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;YM50A電熱蒸汽壓力滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱:寧波來(lái)福科技有限公司;WFJ-7200可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司;CS9301(PC)薄層掃描儀器:日本島津公司。

1.2 發(fā)酵方法

醬油曲霉接種于土豆汁(PDA)斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng) 72 h后,加入 10 mL無(wú)菌生理鹽水,用接種針刮下,調(diào)節(jié)菌液濃度為 0.86×108cfu/m L。取10 g烘干的脫脂芝麻餅粕加入 9m L蒸餾水,于 121℃滅菌 20min,冷卻后,接種 1mL制備好的種子懸液,搖勻,于 28℃條件下發(fā)酵 144 h。

1.3 提取工藝優(yōu)化方法

1.3.1 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在多次單因子對(duì)比試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇提取溶劑乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、總乙醇體積與芝麻餅粕質(zhì)量比(液料比)(C)和提取次數(shù)(D)4個(gè)因素,考察 4因素對(duì)自由基清除率的影響,試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表 1。發(fā)酵結(jié)束后,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入提取液,于 50℃水浴攪拌提取,轉(zhuǎn)速 150 r/min。提取液于5000 r/m in離心 10 min。上清液經(jīng)濃縮或添加提取液,統(tǒng)一定容至 150 mL。對(duì)提取液的自由基清除率進(jìn)行測(cè)定和分析。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels in Orthogonal design

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在探討了乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)對(duì)提取物抗氧化活性影響的基礎(chǔ)上,初步優(yōu)化出3個(gè)主要影響因素。根據(jù) Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度為自變量,自由基清除率為響應(yīng)值,對(duì)這 3個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化,設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)的因素和水平取值見(jiàn)表 2。發(fā)酵條件和提取液處理?xiàng)l件與正交試驗(yàn)一致。

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels in Response Surface design

1.4 DPPH自由基清除活性測(cè)定(Radical Scavenging Activity,RSA)

取定容的發(fā)酵提取液 1mL,用 50%的乙醇稀釋10倍,作為樣品液。DPPH溶液濃度為 7.5×10-6mol/mL,波長(zhǎng) 517 nm,50%乙醇為對(duì)照。測(cè)定清除DPPH自由基的活性,測(cè)定方法參考[9]。

1.5 HPLC檢測(cè)木脂素提取液

發(fā)酵及未發(fā)酵提取液經(jīng) 0.45μm膜過(guò)濾,進(jìn)樣量 10μL,LC-20AT,Shimadzu,Japan;柱徑:Shim-Pack VP-ODS,250 mm×4.6 mm,5 μm;流動(dòng)相 ∶甲醇∶水 =70∶30(v/v);流速 ∶1.0 mL/m in;柱溫 30℃;檢測(cè)器及波長(zhǎng):SPD-20A,波長(zhǎng) 287 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),以芝麻素、芝麻林素標(biāo)準(zhǔn)品做外標(biāo)。

1.6 特征物質(zhì)分離純化及鑒別

1.6.1 特征物質(zhì)的分離純化

采用硅膠柱層析分離,濕法裝柱,干法上樣,不同梯度的石油醚、石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙酯洗脫。并用薄層色譜法檢測(cè),將含有特征物質(zhì)成分的洗脫液合并,適當(dāng)濃縮后自然揮干溶劑析出晶體。

1.6.2 薄層色譜檢測(cè)(TLC)

將點(diǎn)樣的薄層玻板置于層析缸(環(huán)己烷∶乙醚∶乙酸乙酯 =20∶3∶3,v/v/v)中展開。自然晾干后進(jìn)行薄層掃描。步長(zhǎng) 0.04min、光斑大小 1.0×5.0 mm、起始 X:17.0 mm、起始 Y:22.0 mm、結(jié)束 Y:98.0 mm、列間距 18mm、檢測(cè)波長(zhǎng):287 nm、測(cè)光方式:反射、擺幅寬:1.0mm。

1.6.3 質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)

Agilent 1100 LC-MSD,American;鞘氣流速 11 L/min;噴射壓:35 psig;溫度 350℃;毛細(xì)管電壓 4 kV;質(zhì)量掃描范圍 m/z200～800;負(fù)離子源噴射。

2 結(jié)果和討論

2.1 芝麻餅粕木脂素提取條件的優(yōu)化

2.1.1 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

從表 3可知,影響抗氧化物提取率因素的主次為 A＞C＞B＞D,即乙醇濃度對(duì)提取率影響最大,其次為液料比和提取時(shí)間,最弱的為提取次數(shù)。乙醇濃度為 60%時(shí),提取物的平均自由基清除率為71.46%,濃度高于 80%時(shí)的平均清除率為69.02%,但無(wú)顯著的差異,提取次數(shù)之間差異微弱。從提取過(guò)程可操作性及經(jīng)濟(jì)學(xué)考慮,提取溶液體積和濃度,都應(yīng)盡可能減小,且采用單次提取。

表 3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)及結(jié)果Table 3 Design matrix and experimental results of Orthogonal

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表 4,對(duì)所得數(shù)據(jù)采用 Desigh-Expert7.0 Trial軟件中的 RS(response surface)程序進(jìn)行分析,應(yīng)用 Model Graph程序作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

經(jīng)回歸擬合,獲得 Aspergillus發(fā)酵芝麻餅粕提取物抗氧化活性對(duì)自變量提取時(shí)間、液料比和乙醇濃度的二次多項(xiàng)回歸方程為:RSA%=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2

表 4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 Design matrix and experimental resu lts of Response Surface

模型方差分析見(jiàn)表 5,試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P＜0.0001),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0753)。所以自由基清除率與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合優(yōu)度,可用于 Aspergillus固體發(fā)酵提取物抗氧化活性的分析和預(yù)測(cè)。從 3個(gè)因素對(duì)提取物抗氧化活性的影響來(lái)看,回歸方程的一次項(xiàng)中B和 C對(duì)發(fā)酵提取物抗氧化活性的影響極顯著(P＜0.01),且影響能力 B＞C,即液料比 ＞乙醇濃度,提取時(shí)間的線性影響不顯著,各因素二次項(xiàng) A2、B2和 C2的影響也達(dá)到了極顯著水平,交互作用項(xiàng)中僅AC達(dá)到了顯著(P＜0.05)的水平。這也表明了響應(yīng)值的變化復(fù)雜,不僅受單因素的影響,而且還存在交互作用。

表 5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表Table 5 Analysis of variance for the response surface design

*P＜0.05,**P＜0.01

繼續(xù)對(duì)回歸方程進(jìn)行數(shù)學(xué)分析,可得到最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的提取條件,擇優(yōu)的提取條件為:時(shí)間120.40min,液料比 15.70mL/g,乙醇濃度 61.30%,理論提取物抗氧化活性為 82.52%。各因素取值與中心點(diǎn)取值接近,且理論值與中心點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果吻合,故無(wú)需做驗(yàn)證試驗(yàn)。而未發(fā)酵的對(duì)照提取物清除 DPPH自由基活性為 46.8%。

2.2 HPLC檢測(cè)木脂素提取液

由圖 1可知,經(jīng)過(guò)發(fā)酵的提取液 HPLC色譜圖中,在保持時(shí)間為 10.3 min時(shí),發(fā)現(xiàn)一種含量有顯著提高的特征物質(zhì) Px。

圖1 芝麻餅粕木脂素提取物的 HPLC比較Fig.1 Comparison of sesame cake lignan extraction by HPLC

2.3 特征物質(zhì) Px分離純化及鑒別

2.3.1 TLC檢測(cè)結(jié)果

柱層析的特征物質(zhì) Px結(jié)晶經(jīng)過(guò)展開劑展層,紫外掃描的結(jié)果如圖 2所示,特征物質(zhì) Px峰型單一,無(wú)明顯的雜質(zhì)峰,所以柱層析達(dá)到了提純的效果,獲得了單一的純化物。根據(jù)遷移的距離,計(jì)算出芝麻素的 Rf=0.425,特征物質(zhì) Px的 Rf=0.20。

2.3.2 質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)

圖 2 紫外掃描芝麻素和特征物質(zhì)PxFig.2 The UV scanning spectrum of sesamin and Px

對(duì)分離純化的特征物質(zhì)進(jìn)行 ESI/MS分析,質(zhì)子化[M+H+]峰(m/z 370.0)產(chǎn)生的片段如圖 3所示,其分子量為 370 Da,失去一個(gè) H后,變?yōu)?369.0 Da,分子量為:Mr=370.0 Da。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10],確認(rèn)產(chǎn)生的特征物質(zhì)為芝麻素酚,分子組成為:C20H18O7,結(jié)構(gòu)如圖 4所示。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)得出,影響從醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕中提取抗氧化物質(zhì)的各因素的主次順序?yàn)?A＞C＞B＞D,即乙醇濃度對(duì)提取率影響最大,其次為液料比和提取時(shí)間,最弱的為提取次數(shù)。

3.2 利用 Design expert設(shè)計(jì)軟件,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了從發(fā)酵的芝麻餅粕中提取木脂素的較優(yōu)條件為:時(shí)間 120.4min,液料比 15.70mL/g,乙醇濃度 61.3%,在此條件下,發(fā)酵提取物的抗氧化活性可達(dá) 82.52%,未發(fā)酵的對(duì)照為 46.8%。

3.3 HPLC檢測(cè)發(fā)酵的芝麻餅粕木脂素提取物中出現(xiàn)一種特征物質(zhì),利用硅膠柱層析技術(shù)分離純化、薄層色譜檢測(cè)和 LC-MS進(jìn)行鑒別,確認(rèn)該物質(zhì)為芝麻素酚,分子量為:Mr=370.0 Da,分子組成為:C20H18O7。

通過(guò)對(duì)醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕木脂素的提取和分析,發(fā)現(xiàn)一種含量顯著提高的木脂素,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,其主要存在于芝麻油的加工和提煉過(guò)程中。該物質(zhì)在體外和體內(nèi)均有較強(qiáng)的抗氧化能力,并且具有特殊的生理功效,對(duì)其產(chǎn)生機(jī)理和生理活性,有待于進(jìn)一步研究。

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