鄧名榮,郭 俊,朱紅惠*

1華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣州 510006;2廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣州 510070

鏈霉菌(Streptomycete)能產(chǎn)生抗菌、抗腫瘤、抗蟲(chóng)、免疫抑制等廣泛生理活性的代謝產(chǎn)物,是生物活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌[1]。鏈霉菌產(chǎn)生的許多活性代謝產(chǎn)物是通過(guò)聚酮合酶(polyketide synthases,PKSs)途徑和非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)途徑產(chǎn)生的[2]。雖然隨著已知活性物質(zhì)的不斷增加,發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)變得越來(lái)越困難[3-5],但是包括鏈霉菌在內(nèi)的微生物仍然是新活性物質(zhì)的主要來(lái)源[6]。在實(shí)際研究中,微生物的不同種甚至是同種不同株之間所產(chǎn)生的天然產(chǎn)物都有很大不同,商業(yè)上重要的未知天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn),往往是在篩選過(guò)程中獲得了新的微生物菌株?！靶戮?Novel Strains)→新天然產(chǎn)物(Novel Natural Products)→商業(yè)上的成功(Commercial Success)”的篩選模式已被廣泛接受[7]。本實(shí)驗(yàn)室分離到一株鏈霉菌新種,能大量產(chǎn)生罕見(jiàn)的水溶性紫羅蘭藍(lán)色素,該菌命名為粵藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces vietnamensis)[8]。本文報(bào)道了該菌代謝產(chǎn)物的抗菌活性及抗腫瘤活性,并對(duì)該菌的 PKS和 NRPS相關(guān)基因進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞

粵藍(lán)鏈霉菌 GIMV4.0001T,克隆宿主菌大腸桿菌(Escherichia coli)JM109;抗菌活性測(cè)試菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)AS1.16、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)ATCC6633、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)AS1.634、大腸桿菌 ATCC8739、豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella choleraesuis)ATCC13312、銅綠假單胞(Pseudomonasaeruginosa)ATCC9027、甘藍(lán)黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)、白色念珠菌(Candida albicans)ATCC10231;抗腫瘤活性測(cè)試細(xì)胞:人宮頸癌 HeLa細(xì)胞系,均由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.3 試劑與儀器

薄層層析(TLC)硅膠 GF254購(gòu)自青島海洋化工廠,乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為分析純(廣東光華化學(xué)廠有限公司),萃取物在 Buchi R200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮;抗腫瘤試驗(yàn)光吸收值在 LAMBDA E型酶標(biāo)儀上測(cè)定;Taq酶、pMD18-T、內(nèi)切酶等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;PCR在 eppendorf Mastercycler 5333型 PCR儀上進(jìn)行。引物合成、測(cè)序(ABI 3730)均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵和提取

培養(yǎng) 36 h的種子液按5%接種于高氏合成一號(hào)液體培養(yǎng)基中,28℃,180 r/min,振動(dòng)培養(yǎng) 7 d,共發(fā)酵 2 L,發(fā)酵液經(jīng)離心 (6000 g、20min)、過(guò)濾,使菌液分離。發(fā)酵上清液用乙酸乙酯萃取四次,50℃旋轉(zhuǎn)濃縮成粗提物,得率約為 1 g/L。

1.2.2 抗菌活性測(cè)定

采用瓊脂糖擴(kuò)散法。冷卻至 45℃的培養(yǎng)基,加入終濃度約 0.5～3×106cfu/mL的菌體,混勻、倒板,每皿 20 m L,制成含菌平板。培養(yǎng)基凝固后,打孔器打孔(φ5 mm),在孔內(nèi)加入待測(cè)樣品,20μL/孔,在各菌的最適生長(zhǎng)溫度培養(yǎng) 24 h,測(cè)定抑菌圈的直徑。同時(shí)以 100、50μg/mL氨芐青霉素為對(duì)照。

1.2.3 TLC-生物顯影

取乙酸乙酯粗提物溶解在適量甲醇中,毛細(xì)管上樣,在氯仿/甲醇(8:1)中展開(kāi),展層完畢的 TLC板,與含有金黃色葡萄球菌(約 2×106cfu/mL)的NA平板接觸一段時(shí)間后,移除 TLC板,含菌平板于37℃培養(yǎng) 24 h,進(jìn)行生物自顯影。

Step1:提供12個(gè)警告界面I1、I2， …I12，由核電專家分別給12個(gè)警告界面按照上述7個(gè)評(píng)價(jià)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)得分，得到專家評(píng)判矩陣A。

1.2.4 抗腫瘤活性測(cè)定

采用 MTT法。癌細(xì)胞胰酶消化后,配制成 5×104個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液,在 96孔板中,每孔加入 200μL細(xì)胞懸液,空白對(duì)照組加入培養(yǎng)液,置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,加入不同濃度(0、50、100、200、400 μg/mL)的乙酸乙酯粗提物,以10mg/mL 5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照,每孔加入樣品 10 μL,每個(gè)樣品 5個(gè)重復(fù),培養(yǎng) 44 h后加入 5 mg/mL的 MTT溶液 20μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后,吸去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL,150 r/m in振蕩 30min,在酶標(biāo)儀上測(cè)定其 OD490值(以空白對(duì)照組調(diào)零)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 =(1-實(shí)驗(yàn)組/細(xì)胞對(duì)照組)×100%。

1.2.5 PKS/NRPS基因的克隆及分析

粵藍(lán)鏈霉菌基因組 DNA的提取參照文獻(xiàn)[9]。根據(jù)文獻(xiàn)[10,11]及自行設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增 I型和Ⅱ型PKS基因及 NRPS基因(表 1)。PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer(含 20 mmol/L MgCl2)2 μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、上下游引物(10 mmol/L)各 1μL、Taq酶(5 U/μL)0.4 μL/DNA模板 1μL,加 ddH2O至20μL,體系中含有 6%的 DMSO。循環(huán)參數(shù):95℃2.5min;94℃35 s,56℃50 s,72℃2 min(ⅡPF6/Ⅱ PR6、A 3F/A7R引物對(duì)為 1 min),30個(gè)循環(huán);72℃延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收后,按通用方法[12]克隆到 pMD18-T載體上,重組質(zhì)粒經(jīng) EcoRⅠ/HindⅢ酶切驗(yàn)證后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用 Vector NTI Suite 8分析獲得的 DNA序列,同時(shí)在 GenBank中進(jìn)行 BLAST分析,并利用 MEGA 3.1對(duì)Ⅱ型 PKS基因進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。

表 1 用于 PKS/NRPS基因擴(kuò)增的引物列表Table 1 Primer pairs for amplifying PKS/NRPS genes

2 結(jié)果和分析

2.1 抗菌活性

對(duì)所試金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌,乙酸乙酯粗提物在 0.1 mg/mL的低濃度下均有明顯的抑菌圈產(chǎn)生,表明其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有較強(qiáng)的廣譜抑制作用;高濃度下對(duì)銅綠假單胞有抑制作用,而低濃度下對(duì)甘藍(lán)黑腐病菌也有明顯的抑制作用,這表明其對(duì)部分革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用(表 2)。

表 2 乙酸乙酯粗提物對(duì)測(cè)試菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of the inhibition zones of EtOAc extracts against testmicrobes

圖 1 TLC-生物顯影Fig.1 TLC-bioautography

TLC表明,粗提物存在兩個(gè)主要的藍(lán)色組分B1、B2,Rf值分別為 0.63、0.44;展層后的 TLC薄板與含金黃色葡萄球菌的瓊脂接觸5 min,平皿培養(yǎng)過(guò)夜即可在 B1、B2的相應(yīng)位置顯示出兩個(gè)抑菌透明區(qū),這表明 B1、B2是兩個(gè)主要的抗菌活性物質(zhì)(圖1)。當(dāng) TLC薄板與瓊脂接觸時(shí)間延長(zhǎng)至 30 min,培養(yǎng)后平皿上可出現(xiàn)一個(gè)超過(guò)平皿面積一半的大抑菌透明區(qū);接觸過(guò)夜,抑菌透明區(qū)即超過(guò)平皿面積的3/4(結(jié)果未顯示),這也表明藍(lán)色組分 B1、B2對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑制作用。

2.2 抗腫瘤活性

終濃度為 2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL的乙酸乙酯粗提物在 48 h對(duì) HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為 8.2%、23.5%、40.9%、52.7%、81.2%、96.7%,陽(yáng)性對(duì)照 5-氟尿嘧啶(500μg/mL)的抑制率為 60.3%,這顯示粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)生了具有極強(qiáng)抗腫瘤活性的代謝產(chǎn)物(圖 2)。

圖 2 乙酸乙酯粗提物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibtion effect of EtOAc extracts against HeLa cells

2.3 PKS/NRPS基因的克隆及分析

引物 K1F/M 6R可擴(kuò)增 PKSI的酮酰合酶(ketosynthase)及甲基丙二酰 CoA轉(zhuǎn)移酶(methylmalonyl-CoA transferase)兩個(gè)功能域的部分基因序列。電泳檢測(cè)顯示,PCR產(chǎn)物在 1297 bp處有一主條帶,與預(yù)期大小相符(圖 3)。測(cè)序結(jié)果表明,該擴(kuò)增片段(ks1)是典型的 PKSI基因序列 (登錄號(hào):FJ908088);BLAST分析發(fā)現(xiàn),其編碼的氨基酸序列與金鏈菌素 (Aureothin)、Kijanimicin、氯絲菌素(Chlorothricin)、殺念菌素(Candicidin)、南昌霉素(Nanchangmycin)等的 PKS相應(yīng)區(qū)段有較高的同源率(表 3),提示該 PKS可能負(fù)責(zé)具有重要生物活性的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的生物合成。

圖 3 PKS/NRPS基因 PCR電泳檢測(cè)Fig.3 Gelelectrophoresis of PCR products of PKS/NRPSgenes 1.DL5000;2.ks1;3.ks2;4.ks3;5.nrps

表 3 粵藍(lán)鏈霉菌PKSI與其它 PKSI的同源性比較Table 3 Homology alignment of the amp lified PKSI fragmentwith PKSI from other sources

引物ⅡPF6/ⅡPR6擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域是 PKSⅡ酮酰合酶 α鏈 (KSα)羧基端基因序列,PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)顯示,在預(yù)期片段大小處有一主條帶(圖 3),測(cè)序結(jié)果表明,該擴(kuò)增片段(ks2)613 bp(登錄號(hào):EU709745),其編碼氨基酸序列與深藍(lán)鏈霉菌(S.cyaneus(S.curacoi))(X62518)、郝氏鏈霉菌(S.halstedii)(L05390)、天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)A3(2)(X55942)孢子色素 PKS相應(yīng)區(qū)域的同源率分別為 92%、91%、89%;在基于氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)中,其與合成孢子色素的 PKS聚為一枝(圖 4a),推測(cè)該 PKS基因簇負(fù)責(zé)粵藍(lán)鏈霉菌孢子色素的合成。

KSa34F/ⅡPR6擴(kuò)增的是 PKSⅡ基因簇中幾乎全長(zhǎng)的 KSα基因序列,電泳檢測(cè)顯示,PCR產(chǎn)物存在目標(biāo)條帶(圖 3),測(cè)序結(jié)果表明,該擴(kuò)增片段(ks3)長(zhǎng) 1188 bp(登錄號(hào):FJ908089),其編碼氨基酸序列與醌那霉素(Kinamycin)(AY228175)、杰多霉素(Jadomycin)(DS570913)KSα有 94%的同源率。進(jìn)化樹(shù)分析,其與角環(huán)類(lèi)抗生素 PKS聚為一枝(圖 4b)。由于 PKSⅡ是迭代型(iterative)的,酮酰合酶參與了聚酮基本骨架合成的全過(guò)程,因此,可推測(cè)該序列所在基因簇可能負(fù)責(zé)角環(huán)類(lèi)抗生素的生物合成。

引物 A3F/A7R擴(kuò)增的目的片段是 NRPS腺苷?；?adenylation,A)功能域的部分基因序列,PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)顯示,在約 650 bp處存在一條主帶(圖 3),測(cè)序結(jié)果表明,該擴(kuò)增片段(nrps)638bp(登錄號(hào):FJ908087);BLAST分析,序列僅與天藍(lán)色鏈霉菌 A3(2)(AL939113)、阿維鏈霉菌(S.avermitilis)MA-4680(BA000030)、灰色鏈霉菌灰亞種(S.griseus subsp.griseus)NBRC13350(AP009493)三個(gè)基因組測(cè)序的長(zhǎng)鏈脂酰輔酶 A合成酶(long-chain acyl coA synthetase)基因有 90%～91%的同源率,這提示所獲得的序列并不是來(lái)自負(fù)責(zé)合成非核糖體多肽(NRP)的基因簇。

圖 4 基于PKSⅡ基因擴(kuò)增區(qū)域編碼氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of PCR-amplified regions of the PKSⅡgenes

3 討論

鏈霉菌是所有已知生物中產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物最為豐富的屬種之一。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣,不僅對(duì)產(chǎn)生菌本身有著重要的意義,而且對(duì)其它生物也具有廣泛的生理活性,也正因?yàn)槿绱?才使得鏈霉菌在現(xiàn)代醫(yī)藥中占有重要的地位。經(jīng)過(guò)幾十年的篩選,發(fā)現(xiàn)新活性物質(zhì)的幾率越來(lái)越低,篩選獲得新的菌種資源已成為關(guān)鍵因素。另一方面,鏈霉菌遺傳學(xué)的發(fā)展使得各種活性物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)制被不斷闡明,PKS和 NRPS是活性物質(zhì)產(chǎn)生的兩條主要途徑,目前已有數(shù)以百計(jì)的抗生素生物合成基因簇被克隆,基于此的組合生物合成(Combinatorial Biosynthesis)的興起,為新生物活性物質(zhì)的獲得開(kāi)辟了新途徑。

本研究對(duì)新近報(bào)道物種——粵藍(lán)鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯粗提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性,對(duì)部分革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用,兩個(gè)藍(lán)色組分 B1、B2是主要的抗菌活性成分;粗提物對(duì)HeLa腫瘤細(xì)胞也有很強(qiáng)的抑制作用;同時(shí)對(duì) PKS/NRPS相關(guān)基因進(jìn)行了初步分析,獲得 PKS/NRPS基因相關(guān)序列 4條,其中 ks1、ks3與已知的負(fù)責(zé)重要抗生素生物合成的 PKS基因序列有較高的同源性,提示這兩條序列所代表的 PKS基因簇有可能是粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要途徑,這些新基因的發(fā)現(xiàn)也為組合生物合成提供了更多的基因資源。

在鏈霉菌中,有一些種能產(chǎn)生藍(lán)色素。早期的鏈霉菌分類(lèi)系統(tǒng)甚至以藍(lán)色素作為分類(lèi)的一個(gè)主要依據(jù),將產(chǎn)藍(lán)色素的種歸為藍(lán)色類(lèi)群(cyaneus group)。對(duì)初步純化的藍(lán)色組分 B1、B2進(jìn)行1H、13C NMR分析,初步判斷可能為芳香聚酮類(lèi)化合物,二者的譜峰非常相似,提示二者的主成份是同系物(數(shù)據(jù)未顯示)。在已知的藍(lán)色素中,粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)生的藍(lán)色素與天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生的芳香聚酮類(lèi)抗生素放線紫紅素(actinorhodin)[13]最為相似,都具有抗菌活性,能遇酸變紅、遇堿變藍(lán),但二者在色調(diào)上并不相同(紫羅蘭:天藍(lán)色),將乙酸乙酯粗提物進(jìn)行LC/ESI-MS分析,未發(fā)現(xiàn)含有與放線紫紅素或其已知同系物相同分子量的組分;利用放線紫紅素 PKS基因的特異性引物也不能擴(kuò)增出目標(biāo)基因(數(shù)據(jù)未顯示),這些結(jié)果提示,粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)生的藍(lán)色素不同于放線紫紅素,其活性物質(zhì)有可能是新的物質(zhì)。目前進(jìn)一步的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定正在進(jìn)行中。

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