于 波 ,彭愛一 ,齊 鑫 ,曲學(xué)偉 ,李 慧 ,楊 紅

遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,大連 116029

高速逆流色譜(High-Speed Counter-Current Chromatography,HSCCC)是利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同,從而進(jìn)行分離的色譜方法。由于不使用固體支持介質(zhì),避免了因與固體填料發(fā)生不可逆吸附造成的樣品損失,使樣品得以全部回收,具有分離容量大、高效、快速的特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物,化學(xué),食品工業(yè)等領(lǐng)域。由于該技術(shù)具有高承載量,高分離度的特點(diǎn),適于有效的分離純化傳統(tǒng)中藥當(dāng)中的活性成分[1-3]。

青皮 (Pericarpium citri Reticulatae Viride),為蕓香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)果皮。是《中國(guó)藥典》記載的最為常用的傳統(tǒng)中藥植物之一,中醫(yī)用煎劑內(nèi)服治療胸肋脹痛、胃部痞滿、疝氣、食積、乳腫、乳核等癥。青皮中主要含有黃酮、揮發(fā)油和少量氨基酸成分,其中黃酮類化合物含量較高。PMFs作為青皮中的抗癌活性成分,對(duì)多種癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。最近發(fā)現(xiàn)橘皮素具有保護(hù)細(xì)胞抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞毒素[4],抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖[5]等作用。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)青皮中的黃酮類成分,利用 HSCCC從青皮粗提物中分離純化到六種具有生物活性的 PMFs,其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1。

圖 1 6種多甲氧基黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 6 polymethoxyflavone compounds

1 儀器與材料

TBE-300高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司),包括 TBP-50A泵,TBD-23UV紫外檢測(cè)器(254 nm),N2000雙通道色譜工作站;waters2695高效液相色譜儀(美國(guó) waters公司),二級(jí)管陣列PDA檢測(cè)器(型號(hào) waters2996,檢測(cè)波長(zhǎng)范圍 190 nm～800 nm);Quattro Micro質(zhì)譜儀 (美國(guó) waters公司);500兆赫超導(dǎo)核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)(AVANCE500 Hz型,瑞士 Bruker公司)。石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),95%乙醇(盤錦天源藥業(yè)有限公司),無(wú)水乙醇(北京化工廠),水為自制三蒸水及娃哈哈純凈水;HPLC所用的甲醇、乙腈均為色譜純?cè)噭?Honeywell)、冰乙酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司),D101大孔樹脂(天津市大鈞科技開發(fā)有限公司)。

藥材購(gòu)自于吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王冰教授鑒定為青皮(Pericarpium citriReticulatae Viride)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮的提取和富集

青皮樣品干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過 100目篩,得到青皮粉末 100 g。提取方法為:加 800mL 95%乙醇,回流提取 2次,每次 6 h。過濾,合并濾液,減壓回收乙醇,得浸膏 24 g。將浸膏用 50倍體積的氯仿 -甲醇-水(2∶1∶1)體系萃取 ,靜置 1 h后分離下相,減壓回收下相,濃縮至浸膏。加適量水混懸后,過裝有 D101大孔吸附樹脂的層析柱(40 cm ×3.0 cm i.d.),靜止吸附 1 h后,依次用水、75%甲醇和95%甲醇洗脫,接收 95%甲醇洗脫物,減壓濃縮至浸膏后真空干燥(60℃),得棕黃色粉末 3.93 g,放入 4℃冰箱保存。

2.2 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實(shí)驗(yàn)中 HSCCC溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水 (4∶6∶4∶6,V/V),按比例將四種溶劑加入分液漏斗中,振蕩使溶液充分混合,室溫下靜置過夜,使用前分得上相(固定相)和下相(流動(dòng)相),超聲脫氣 30 min以備用。稱取 270 mg青皮粗提物,溶于 18m L下相中,得 15 mg/mL樣品溶液。

2.3 HSCCC的分離制備過程

將已超聲脫氣后的上相(固定相),以 20 mL/min的速度泵入 HSCCC分離管中,待上相充滿整個(gè)管路(約 12 min),設(shè)定分離管順時(shí)針旋轉(zhuǎn),緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)至 800 r/min,同時(shí)以 2 mL/min流速注入下相,兩相達(dá)到平衡后由進(jìn)樣閥注入 18 mL樣品溶液,同時(shí)采集數(shù)據(jù),通過紫外檢測(cè)器(254 nm)檢測(cè)流出物,按照色譜峰接收目標(biāo)餾分。

2.4 HPLC分析條件

色譜柱:XTerra MS C18柱(2.1×150 mm,5 μm)。流動(dòng)相 A:乙腈,B:0.2%乙酸;梯度程序:0～25min,流動(dòng)相 A由 10%升至 90%,流速 0.2mL/min;柱溫箱溫度 35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)范圍:200～600 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

由于黃酮類化合物易溶解于甲醇、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,微溶于水、乙醚,且青皮 95%乙醇提取物中含有親水性黃酮苷以及氨基酸類成分,以 3和 5的含量(面積歸一化法)為例只占總提取物17.07%和 12.61%。若采用有機(jī)溶劑逐級(jí)萃取方法來(lái)處理該樣品,體系的樣品溶解量小,水相體積過大,有機(jī)相萃取次數(shù)增多。采用氯仿-甲醇-水體系萃取,使粗提物以溶液狀態(tài)在上、下相間達(dá)到分配平衡:極性成分分布于上相(水相),弱極性成分分布于下相(氯仿相)。在此基礎(chǔ)上通過大孔樹脂梯度洗脫,收集 95%甲醇洗脫液,經(jīng) HPLC測(cè)定二者含量提升至 35.96%和 34.06%(圖 3)。因此該方法具有萃取體系小,分配時(shí)間短且分配完全,簡(jiǎn)化中間過程等優(yōu)點(diǎn),有利于提高 HSCCC的分離純化效率。

3.2 HSCCC分離條件的選擇

現(xiàn)有文獻(xiàn)多數(shù)報(bào)道使用 HSCCC分離黃酮苷的方法,而能夠高效分離制備多甲氧基黃酮的方法較少,體系主要為氯仿-甲醇-水,石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水,正己烷 -乙酸乙酯-甲醇 -水 。已有文獻(xiàn)報(bào)道使用石油醚∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水 (2∶4∶3∶3)可分離青皮中橙皮苷 、橘皮素 、5-羥基-6,7,8,3′,4′-五甲氧基黃酮。但對(duì)于使用 HSCCC同時(shí)分離六種 PMFs的方法尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷/水為主溶劑,分別通過調(diào)節(jié)溶劑體系在不同體積的配比,考察了青皮中各組分的分配系數(shù),篩選出了對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中青皮粗提物的各組分整體分離效果較好、固定相保留率較高的體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 1。

表 1 青皮粗提物中六種化合物在不同比例的溶劑體系中的分配系數(shù)Table 1 Partition coefficients of six compounds of Pericarpium citriReticulatae Viride crude extracts in different p roportion solvent systems

從表 1中可以看出當(dāng)溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇 -水 (3∶6∶3∶6)和 (2∶6∶2∶6)時(shí),各組分的分配系數(shù)普遍較大,因此體系極性偏強(qiáng)不適合該粗提物的分離純化。而當(dāng)體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇 -水 (5∶5∶5∶5)時(shí)各組分的分配系數(shù)都較小 ,這樣分配系數(shù)小的組分就容易與無(wú)保留的雜質(zhì)相混淆并且出峰過快影響分離度;因此得出較適合的體系為正己烷 -乙酸乙酯-甲醇 -水 (4∶5∶4∶5)和 (4∶6∶4∶6),在其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)均相同的條件下,分別應(yīng)用兩體系對(duì)青皮粗提物進(jìn)行分離純化,結(jié)果證明正己烷-乙酸乙酯-甲醇 -水 (4∶6∶4∶6)在總的分離時(shí)間 ,以及對(duì)化合物 1～6分離純化等方面都優(yōu)于正己烷-乙酸乙酯 -甲醇-水(4∶5∶4∶5),對(duì)于化合物 6采用回收分離管中溶液,甲醇重結(jié)晶的方法純化。因此本實(shí)驗(yàn)最終選用正己烷-乙酸乙酯 -甲醇-水(4∶6∶4∶6)作為分離純化的溶劑體系。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)樣品的一次進(jìn)樣量進(jìn)行了優(yōu)化,考察了進(jìn)樣濃度分別為 8、15、25 mg/mL時(shí),對(duì)青皮粗提物分離的影響。當(dāng)進(jìn)樣濃度為 25mg/m L時(shí),樣品的分離度較差,化合物 1、2不能有效分離。而當(dāng)進(jìn)樣量為 8mg/mL和 15 mg/mL時(shí),樣品都有較好的分離度,且無(wú)明顯差別,因此本實(shí)驗(yàn)選擇的進(jìn)樣濃度為 15mg/m L。

3.3 HSCCC分離制備的結(jié)果

將“2.2”節(jié)得到的青皮樣品溶液按照“2.3”節(jié)所述步驟進(jìn)行分離,固定相保留率為 50%,分離時(shí)間為 460min,根據(jù) HSCCC圖(圖 2)手動(dòng)分段收集,得到組分 1～5。將 5種組分減壓濃縮干燥,稱得質(zhì)量分別為 3.5 mg、13.9 mg、51.3mg、9.5 mg、44.7 mg,組分 6經(jīng)重結(jié)晶后得 11.2mg。

圖 2 青皮粗提取的高速逆流色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of the crude extract For peaks 1-6,see Fig 1.

3.4 HPLC檢測(cè)分析

采用“2.4”節(jié)的條件,對(duì)青皮樣品及組分 1～6分別進(jìn)行 HPLC檢測(cè)(圖 3,4),面積歸一化法測(cè)定六種化合物的純度為:97.8%、98.4%、100%、97.6%、99%、98.1%。此結(jié)果表明,利用高速逆流色譜對(duì)青皮中的活性化合物進(jìn)行大量分離制備的方法高效可行。

圖 3 青皮粗提物的HPLC圖Fig.3 H igh performance liquid chromatography of Pericarpium citri Reticulatae Viride crude extracts Peaks 1-6,see Fig 1.

圖 4 從圖 2中分離得到的五種化合物的HPLC圖Fig.4 H igh performance liquid chromatography of five compounds(1、2、3、4、5)isolated by HSCCC.High performance liquid chromatography of recrystallized compound 6

3.5 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1 黃色針狀結(jié)晶(甲醇),mp.178～179℃,ESI-MSm/z:373[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.44(1H,dd,J=8.9,2.1 Hz,H-6′),7.23(1H,d,J=2.1Hz,H-2′),6.92(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),6.74(1H,s,H-8),6.55(1H,s,H-3),3.98(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3),3.92(3H,s,OCH3),3.90(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3)。1H NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致,故鑒定化合物 1為 5,6,7,3′,4′-五 甲氧 基 黃酮,即甜橙素(Sinensetin)。

化合物 2 黃色粉末(甲醇),mp.216～217℃,ESI-MSm/z:343[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.89(2H,d,J=8.9 Hz,H-2′,6′),7.02(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),6.60(1H,s,H-3),6.44(1H,s,H-6),4.00(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),3.88(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3):162.2(C-2),107.1(C-3),177.8(C-4),152.0(C-5),92.8(C-6),156.5(C-7),130.9(C-8),156.3(C-9),109.2(C-10),124.0(C-1′),127.7(C-2′),114.5(C-3′),160.7(C-4′),114.5(C-5′),127.7(C-6′),61.6(OCH3),56.7(OCH3),56.3(OCH3),55.5(OCH3)。NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]一致,故鑒定此化合物 2為 5,7,8,4′-四甲氧基黃酮。

化合物 3 黃色針狀結(jié)晶(甲醇),mp.136～137℃,鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈橙紅色。ESI-MSm/z:403[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.62(1H,s,H-3),7.42(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.00(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.57(1H,dd,J=8.5,2.1 Hz,H-6′),3.97(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),4.03(3H,s,OCH3),4.10(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:161.1(C-2),106.9(C-3),177.3(C-4),144.2(C-5),149.4(C-6),138.1(C-7),148.5(C-8),147.8(C-9),108.7(C-10),124.1(C-1′),111.3(C-2′),152.0(C-3′),151.5(C-4′),114.9(C-5′),119.7(C-6′),62.3(OCH3),62.0(OCH3),61.8(OCH33),61.7(OCH3),56.1(OCH3),56.0(OCH3).1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致,故鑒定為 5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黃酮 ,即川陳皮素(Nobiletin)。

化合物 4 黃色針晶(乙酸乙酯),mp.125～127 ℃,ESI-MSm/z:433[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.81(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),7.01(1H,d,J=8.6 Hz,H-5′),7.84(1H,dd,J=8.6,2.0 Hz,H-6′),4.10(3H,s,OCH3),4.01(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3),3.89(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3):151.1(C-2),143.9(C-3),173.9(C-4),146.8(C-5),140.8(C-6),151.3(C-7),137.9(C-8),148.2(C-9),115.1(C-10),123.5(C-1′),111.1(C-2′),148.9(C-3′),153.1(C-4′),111.2(C-5′),122.0(C-6′),62.3(OCH3),61.9(OCH3),61.8(0CH3),61.7(0CH3),59.9(0CH3),56.0(OCH3),56.0(OCH3)。 NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致,故鑒定此化合物 4為 3,5,6,7,8,3′,4′-七甲 氧基 黃 酮 (3,5,6,7,8,3′,4′-Heptame-thoxyflavone)。

化合物 5 黃色針晶(甲醇),mp.49～51℃,ESI-MSm/z:373[M+H]+。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.60(1H,s,H-3),7.88(2H,m,H-2′,6′),7.03(2H,m,H-3′,5′),3.95(3H,s,OCH3),3.95(3H,s,OCH3),4.02(3H,s,OCH3),4.10(3H,s,OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:62.3(C-2),106.8(C-3),177.3(C-4),147.8(C-5),144.1(C-6),151.4(C-7),138.1(C-8),148.4(C-9),106.8(C-10),123.9(C-1′),127.7(C-2′),114.6(C-3′),161.2(C-4′),114.5(C-5′),127.7(C-6′),62.3(OCH3),62.0(OCH3),61.8(OCH3),61.7(OCH3),55.5(OCH3)。以上 NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致,故鑒定為 5,6,7,8,4′-五甲氧基黃酮,即橘皮素(Tangeretin)。

化合物 6 黃色針晶(乙酸乙酯),mp.144～145℃,ESI-MSm/z:388[M]+。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ:7.59(1H,dd,J=8.5,2.1 Hz,H-6′),7.43(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.01(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.61(1H,s,H-3),4.11(3H,s,OCH3),3.99(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),3.97(3H,s,OCH3),3.96(3H,s,OCH3),12.54(1H,s,5-OH);13C NMR(125MHz,CDCl3):164.0(C-2),104.0(C-3),183.0(C-4),145.8(C-5),136.7(C-6),152.6(C-7),133.0(C-8),149.5(C-9),107.1(C-10),123.8(C-1′),108.9(C-2′),149.5(C-3′),153.0(C-4′),111.4(C-5′),120.2(C-6′),62.1(OCH3),61.7(OCH3),61.1(OCH3),56.2(OCH3),56.1(OCH3)。NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]一致,故鑒定此化合物 6為 5-羥基 -6,7,8,3′,4′,-五甲氧基黃酮,即 5-去甲川陳皮素(5-O-DesmethylNobiletin)。

4 結(jié)論

本文首次研究了使用高速逆流色譜分離制備青皮中六種黃酮類成分的方法,分離產(chǎn)物經(jīng) HPLC,MS,NMR分析,結(jié)果證明該方法成功獲得高純度,高質(zhì)量的多甲氧基黃酮類化合物。與常規(guī)反復(fù)過硅膠柱的方法相比,該方法具有快速,高效,節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)。 3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮具有較強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞增殖,并能促使癌細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變,有較高的藥用價(jià)值。川陳皮素和橘皮素是我國(guó)藥典規(guī)定的青皮中的標(biāo)志性成分,得到的高純度樣品可以作為標(biāo)準(zhǔn)品用于分析測(cè)試或藥理與毒理試驗(yàn),該方法也為分離相似化合物提供技術(shù)參考。

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