張慶英 周 莉 張東紅 易德青 周太梅

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一,全球每年約有 14.2萬例婦女患病,其中 4.2萬人死于該疾病[1]。隨著生活方式的變化,EC在我國(guó)婦女中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。近年來的研究表明,EC的發(fā)生與抑癌基因失活有關(guān),而基因異常甲基化是抑癌基因失活的 1種重要機(jī)制。DNA相關(guān)區(qū)域的每個(gè) CpG位點(diǎn)有特異性的甲基化修飾,導(dǎo)致復(fù)雜的信息類型,形成特異性 CpG甲基化譜 (CIMP)。多基因甲基化研究可為不同類型腫瘤和同一腫瘤不同階段提供豐富的表觀遺傳信息。本研究擬采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylated specific PCR,MSP)技術(shù),檢測(cè) EC癌組織和癌旁配對(duì)組織以及正常子宮內(nèi)膜組織中 5種腫瘤相關(guān)基因P14、P16、ER、RASSF1A、COX-2的甲基化及 CIMP狀態(tài),并分析其潛在的意義,以期進(jìn)一步闡述 EC的表觀遺傳分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

35例 EC組織標(biāo)本及 15例相應(yīng)的癌旁組織,來自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 2006年 1月至 2007年6月間手術(shù)切除標(biāo)本,新鮮組織標(biāo)本迅速保存于 -70℃冰箱。患者年齡為 46～67歲(平均年齡 53.3歲),所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療,腫瘤病理組織學(xué)分類按 WHO統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),病理分級(jí)和臨床分期按 FIGO統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)該院病理科核實(shí)。另收集年齡 44～64歲、平均年齡 51.5歲的婦女炎性息肉、增生子宮內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組織共 22例,作為正常對(duì)照。

1.2 研究方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜癌、癌旁及正常組織 DNA的提取上述組織 DNA提取嚴(yán)格按照安徽優(yōu)晶生物工程有限公司的組織 DNA提取試劑盒 (JYZ-2-1-3)說明書操作,提取后的組織 DNA放于 -20°C冰箱保存。

1.2.2 DNA亞硫酸鹽修飾及 MSP 取 10μg基因組DNA,補(bǔ)加 TE至 30μl,加入 3.3μl 3mol/L的 NaOH(溶液終濃度為 0.3 mol/L),吸頭上下混勻后,37℃孵育 15min。配制 2.4 mol/L亞硫酸鈉溶液,取 333μl到 DNA溶解液中,用吸頭充分混勻,避光 55℃孵育4 h。用 DNA純化柱(promage,A 7280)純化除鹽。操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行,純化后的 DNA于 -80℃保存于25μl TE中備用。檢測(cè) 5種基因甲基化所用的引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[3],具體序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(由上海申能博彩公司合成)見表 1。

表1 MSP甲基化分析引物與非甲基化引物序列表

PCR反應(yīng)混合物體系 25μl,包括 10×PCR Buffer 2.5μl,25mmol/L dNTP 2.5μl,10 mmol/L上下游引物 P1/P2各 1μl,修飾過的 DNA 2μl,2.5U Taq酶 1 μl,去離子水 15μl。以正常子宮內(nèi)膜組織 DNA為對(duì)照,以去離子水代替模板 DNA作為空白對(duì)照。擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性 10 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán),72℃延伸 10m in,4℃保存。將 8μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,20 min),紫外成像分析儀下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 CIMP的定義 參照文獻(xiàn)[4],選擇子宮內(nèi)膜癌組織甲基化基因平均數(shù)作為基準(zhǔn),大于此均數(shù)者為 CIMP+,本研究檢測(cè)的 5種基因中,如果出現(xiàn) 3個(gè)或以上基因同時(shí)甲基化則為 CIMP+;2個(gè)或 2個(gè)以下基因同時(shí)甲基化則為 CIMP-。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)和 Fisher精確概率計(jì)算法,P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌、癌旁及正常子宮內(nèi)膜組織中基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾狀況

采用 MSP方法,檢測(cè) 35例癌組織,15例癌旁組織及 22例正常組織中 5種腫瘤相關(guān)基因(P14、P16、ER、RASSF1A、COX-2)啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾狀況。根據(jù)MSP電泳結(jié)果 (圖 1)分為三類甲基化結(jié)果:①高甲基化修飾:只有甲基化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,提示啟動(dòng)子區(qū)有甲基化修飾;②只有未甲基化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,提示啟動(dòng)子區(qū)沒有甲基化修飾;③當(dāng)甲基化和未甲基化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均有時(shí),提示啟動(dòng)子區(qū)為部分甲基化修飾。

圖1 MSP法檢測(cè) 5種基因甲基化電泳圖

本組結(jié)果顯示,5種基因在 EC組織中的啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率從 P16的 37%至 P14的 57%不等,在癌旁配對(duì)組織中則從 P16的 27%至 P14的 60%不等。正常子宮內(nèi)膜組織中僅有 2例表現(xiàn)為 ER和 COX-2甲基化,4例RASSF1A甲基化,P14和P16沒有甲基化。其中 5種基因的甲基化頻率 EC組織中與癌旁組織分別為P16(37%vs.27%),COX-2(54%vs.47%),RASSF1A(57%vs.40%),P14(57%vs.60%),ER(52%vs.53%),兩組分別比較,差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表 2。然而,EC組織與癌旁組織中 5種基因甲基化頻率均高于正常組織(P＜0.01)。

2.2 EC、癌旁組織和正常組織中 CIMP頻率

進(jìn)一步分析 5種基因在上述組織中的甲基化修飾狀況,發(fā)現(xiàn) 97%(34/35)的 EC組織中至少有 1個(gè)或1個(gè)以上基因啟動(dòng)子存在甲基化修飾,只有 1例 EC組織沒有檢測(cè)到甲基化修飾。35例 EC組織中,6例(17%,6/35)有 1個(gè)基因甲基化,11例 (31%,11/35)有 2個(gè)基因甲基化,7例 (20%,7/35)有 3個(gè)基因甲基化,9例 (26%,9/35)有 4個(gè)基因甲基化,1例(3%,1/35)有 5個(gè)基因甲基化。平均每例 EC組織中有(2.57±1.22)個(gè)(中位數(shù)為 2.0)甲基化基因。在 15例癌旁組織中,1例 (6%,1/15)沒有基因甲基化,4例 (27%,4/15)有 1個(gè)基因甲基化,3例 (20%,3/15)有 2個(gè)基因甲基化,4例 (27%,4/15)有 3個(gè)基因甲基化,3例 (20%,3/15)有 4個(gè)基因甲基化,平均每例癌旁組織中有(2.27±1.28)個(gè)(中位數(shù)為 2.0)甲基化基因。而 22例正常子宮內(nèi)膜組織中,只有 6例出現(xiàn) 1個(gè)基因甲基化,其他 18例沒有檢測(cè)到基因甲基化。

在 35例 EC組織、15例癌旁組織和 22例正常子宮內(nèi)膜組織中,46%(17/35)的 EC組織為 CIMP+,54%(18/35)EC組織為 CIMP-;47%(7/15)癌旁組織為 CIMP+,53%(8/15)癌旁組織為 CIMP-;而在正常組織中則沒有 CIMP+。CIMP在 EC組織與癌旁組織中差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.574)。

2.3 CIMP狀態(tài)與腫瘤相關(guān)基因甲基化的關(guān)系

17例 CIMP+的腫瘤組織中,甲基化頻率最高的基因?yàn)?COX-2(88%),其余分別為 P14(71%)、P16(71%)、RASSF1A(71%)和 ER(65%)。CIMP+與P16(γ=0.673)和 COX-2(γ=0.662)的甲基化密切相關(guān)(P＜0.001),見表 3。

表2 子宮內(nèi)膜癌及其癌旁組織中 5種基因甲基化頻率情況(例,%)

表3 子宮內(nèi)膜癌中 CIMP狀態(tài)與 5種基因甲基化的關(guān)系(例,%)

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多病因、多步驟的過程,其中包括原癌基因的活化,抑癌基因的失活,細(xì)胞循環(huán)調(diào)控基因、腫瘤侵襲相關(guān)基因以及錯(cuò)配修復(fù)基因的功能紊亂等。但是這些異?；?qū)е抡＜?xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的具體機(jī)制仍不清楚。DNA甲基化尤其是基因啟動(dòng)子區(qū) CpG島的高甲基化,會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的下降或沉默。甲基化抑制基因的表達(dá)目前認(rèn)為要有兩個(gè)方面,一方面甲基化引起的基因結(jié)構(gòu)改變可直接阻礙一些轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位的結(jié)合;另一方面可能與一些甲基化相關(guān)蛋白的作用有關(guān),甲基化 CpG結(jié)合蛋白可以占據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),從而抑制基因的表達(dá)。

許多研究表明,子宮內(nèi)膜癌中存在多種腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū) DNA甲基化現(xiàn)象,包括細(xì)胞周期調(diào)控、血管形成、凋亡等基因啟動(dòng)子甲基化的紊亂,直接影響細(xì)胞周期和信號(hào)傳導(dǎo)途徑,細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等相繼異常,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5～7]。雌孕激素受體(ER,PR)甲基化與子宮內(nèi)膜癌 Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族 1A基因(RASSF1A)啟動(dòng)子區(qū)域在婦科惡性腫瘤細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)與 p16基因轉(zhuǎn)錄抑制高度相關(guān)[6,7]。P16-cyclinD-cDK4-RB是 1個(gè)重要的基因網(wǎng)絡(luò),在細(xì)胞調(diào)控中起著異常關(guān)鍵的作用,這個(gè)網(wǎng)絡(luò)體系涉及的很多基因在子宮內(nèi)膜癌都存在異?，F(xiàn)象,因此可能是其發(fā)生的 1個(gè)重要基因變異機(jī)制,P16甲基化可能是 1個(gè)始發(fā)事件導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控基因失活[8]。COX-2及其主要的酶代謝物前列腺素 E2,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),并可能是預(yù)測(cè)早期宮頸癌的 1個(gè)標(biāo)志物[9,10]。目前對(duì)于上述這些子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因的研究多限于單個(gè)基因的甲基化修飾,對(duì)于多基因的在組織中的甲基化狀態(tài)研究卻較少。但已有的研究提示多個(gè)相關(guān)基因特異性位點(diǎn)甲基化,在不同的組織和同一組織不同階段,形成特異性的甲基化譜,與腫瘤的早期診斷、臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)[11,12]。

我們的檢測(cè)結(jié)果表明,子宮內(nèi)膜癌組織中 5種基因的甲基化頻率從 10%(P16)至 94%(P14)不等,97%腫瘤組織中至少有 1個(gè)基因發(fā)生甲基化。P14、P16、ER、RASSF1A、COX2在 EC組織中同時(shí)甲基化現(xiàn)象頻繁發(fā)生,這些結(jié)果提示多基因同時(shí)甲基化在 EC癌變中有重要作用。同時(shí),異常的 CIMP+主要在子宮內(nèi)膜癌及相鄰癌旁組織中而不是正常的內(nèi)膜組織中,說明多基因甲基化在癌前病變或患者組織學(xué)正常的組織中存在,可能是癌變的早期事件。此外,P16和 COX-2的甲基化與 CIMP+狀態(tài)相關(guān)。周莉等實(shí)驗(yàn)曾報(bào)道發(fā)生 P16甲基化的子宮內(nèi)膜癌組織大多屬癌變?cè)缙?未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)程度較低,且甲基化與腫瘤晚期的標(biāo)志物 CA125水平呈負(fù)相關(guān)[13]。相反的是,肝細(xì)胞癌中 P15和 P16甲基化與血清中的甲胎蛋白水平呈正相關(guān)[14]。這些證據(jù)也支持 CIMP+可能是子宮內(nèi)膜癌癌變的早期事件這一觀點(diǎn),但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics 2008〔J〕.CA Cancer JClin,2008,58(2):71.

[2] Jin F,Devesa SS,Chow WH,et al.Cancer incidence trends in urban shanghai,1972-1994:an update〔J〕.Int JCancer,1999,83(4):435.

[3] Zochbauer Muller S,Fong KM,Virmani A,et al.Aberrant promoter methylation of multip le genes in non-small cell lung cancers〔J〕.Cancer Res,2001,61(1):249.

[4] Oue N,Mitani Y,Motoshita J,et al.Accumulation of DNA methylation is associated with tumor stage in gastric cancer〔J〕.Cancer,2006,106(6):1250.

[5] Yamaguchi S,Asanoma K,Takao T,et al.Homeobox gene HOPX is epigenetically silenced in human uterine endometrial cancer and supp resses estrogen-stimu lated proliferation of cancer cells by inhibiting serum response factor〔J〕.Int J Cancer,2009,124(11):2577.

[6] Ignatov A,Bischoff J,Schwarzenau C,et al.P16 alterations increase the metastatic potential of endometrial carcinoma〔J〕.Gynecol Oncol,2008,111(2):365.

[7] Arafa M,Kridelka F,Mathias V,et al.High frequency of RASSF1A and RARb2 gene promoter methylation in morphologically normal endometrium ad jacent to endometrioid adenocarcinoma〔J〕.Histopathology,2008,53(5):525.

[8] Iwasa A,Oda Y,Kurihara S,et al.Malignant transformation ofmature cystic teratoma to squamous cell carcinoma involves altered expression of p53-and p16/Rb-dependent cell cycle regulator proteins〔J〕.Pathol Int,2008,58(12):757.

[9] Greenhough A,Smartt HJ,Moore AE,et al.The COX-2/PGE2 pathway:key roles in thehallmarks of cancer and adap tation to the tumourm icroenvironment〔J〕.Carcinogenesis,2009,30(3):377.

[10] Hoenil J,Sokbom K,JaeWK,etal.Hypermethylation of the COX-2 gene is a potential p rognostic marker for cervical cancer〔J〕.JObstet Gynaecol Res,2007,33(3):236.

[11] Jiang SW,Li J,Podratz K,etal.Application of DNA methylation biomarkers for endometrial cancer management〔J〕.ExpertRev Mol Diagn,2008,8(5):607.

[12] Brock MV,Gou M,Akiyama Y,et al.Prognostic im portance of promoter hypermethylation ofmultip le genes in esophageal adenocarcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,2003,9(8):2912.

[13] 周 莉,黃 萍,朱安娜.子宮內(nèi)膜癌中 p16甲基化、Her-2表達(dá)及血清 CA125水平與臨床病理特征的關(guān)系〔J〕.癌變·畸變·突變,2009,21(2):141.

[14] Zhang CS,Li ZY,Cheng Y,et al.CpG island methylator phenotype association with elevated serumα-fetoprotein level in hepatocellular carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,2007,13(3):944.