廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 黃 和 王 玲 陳仰真

菠蘿是我國南方栽培面積較大，產(chǎn)量較多的典型熱帶水果之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年菠蘿產(chǎn)量約200萬噸。由于新鮮菠蘿果實(shí)不易貯存，除少部分直接鮮銷外，大部分被加工成罐頭、果汁、果醬、果酒等產(chǎn)品。在這些菠蘿產(chǎn)品的加工過程中，占全果重的50%～60%的菠蘿果實(shí)加工副產(chǎn)物——果皮渣通常被加工廠直接丟棄，既浪費(fèi)了資源，又造成一定程度的環(huán)境污染。資料表明，菠蘿皮渣中的水分、總酸和總糖等含量與果肉相差無幾，粗蛋白質(zhì)和灰分的含量還高于果肉，分別是后者的2.5倍和 3.0 倍（Sanchaisurinya 和 Thammabut，1994）；另外，菠蘿皮中還富含適合微生物生長的纖維素等碳源物質(zhì)。

本研究以菠蘿皮為原料，烘干粉碎后按一定比例加入麩皮等輔料，分別接種單一霉菌、酵母菌以及霉菌與酵母菌混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)高產(chǎn)蛋白飼料，對(duì)各發(fā)酵條件下所得的產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量、感官指標(biāo)等進(jìn)行了考核，以期獲得理想的高產(chǎn)蛋白菠蘿皮渣發(fā)酵菌種，為菠蘿皮渣高效發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 菠蘿皮渣：取自廣東湛江鷹峰食品有限公司菠蘿罐頭加工車間。取回后于80℃烘干粉碎備用，研究時(shí)按以下配方做成培養(yǎng)基：菠蘿皮渣（干粉）74%，麩皮 20%，（NH）2SO43%，尿素 2%，KH2PO41%，料水比為 1∶1，自然 pH 值。

菌種：白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、扣蘘擬內(nèi)孢霉、黑曲霉、綠色木霉2、綠色木霉1，對(duì)應(yīng)的代號(hào)為 1、3、4、5、6、7、8， 購自廣東省微生物所；菠蘿皮發(fā)酵篩選酵母、菠蘿皮發(fā)酵篩選霉菌1、菠蘿皮發(fā)酵篩選霉菌 2，對(duì)應(yīng)的代號(hào)為 2，9，10，是由本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的，未經(jīng)過鑒定。

1.2 主要藥品及試劑 尿素、（NH）2SO4、KH2PO4、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 主要儀器和設(shè)備 鼓風(fēng)干燥箱、組織粉碎機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)等。

1.4 分析檢驗(yàn)方法 水分含量的測(cè)定：常壓干燥法（GB/T 5009.3-2003）；灰分的測(cè)定：灰化法（GB/T 5009.4-2003）；粗脂肪的測(cè)定：索式抽提法（GB/T 5009.6-2003）；粗纖維的測(cè)定：酸堿洗滌法（GB/T 5009.10-2003）； 還原糖的測(cè)定：3，5-二硝基水楊酸法，大連輕工業(yè)學(xué)院（1994）；纖維素酶酶活的測(cè)定方法：分光光度法（NY/T 912-2004）；原料粗蛋白質(zhì)的測(cè)定：飼料中粗蛋白質(zhì)測(cè)定方法（GB/T 6432-1994）；發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：飼料中粗蛋白質(zhì)測(cè)定方法（GB/T 6432-1994）；發(fā)酵產(chǎn)物水洗含氮化合物后粗蛋白質(zhì)（簡(jiǎn)稱水洗蛋白）含量的測(cè)定：飼料酵母中水洗蛋白測(cè)定方法（QB/T 1940-1994）。

1.5 研究方法

1.5.1 單一菌種篩選試驗(yàn) 按1.1中的配方配制培養(yǎng)基（以下同），以5%的接種量分別接入單一霉菌和酵母菌的擴(kuò)大培養(yǎng)液，在28℃下霉菌培養(yǎng)108 h，酵母菌培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)物在80℃烘干后分別測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量、水洗蛋白含量，預(yù)選出蛋白質(zhì)含量較高的酵母和霉菌。

1.5.2 混合菌種篩選試驗(yàn) 將1.5.1方法選出的酵母和霉菌分別以不同的組合按1∶1的比例、5%的總接種量接入培養(yǎng)基中，進(jìn)行雙菌種混合發(fā)酵，28℃培養(yǎng)108 h后，測(cè)定蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，選出產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量高的組合為最優(yōu)組合。

1.5.3 混合菌種的接種比例和接種量的確定 將混合菌種發(fā)酵所選出的產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量最高的組合分別按不同的接種比例、不同的接種量進(jìn)行混合菌種發(fā)酵試驗(yàn)，28℃培養(yǎng)108 h后，測(cè)定蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，最終確定理想的發(fā)酵菌種的接種比例和接種量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種篩選試驗(yàn) 用10株不同的霉菌和酵母菌株進(jìn)行單一菌種發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定各發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量及水洗蛋白含量，結(jié)果見表1。

由表1可知：發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量高的，水洗蛋白含量不一定高，這是因?yàn)楦鞣N微生物對(duì)含氮化合物的利用情況各不相同。在選取優(yōu)良菌種時(shí)，應(yīng)選擇對(duì)含氮化合物利用較好的菌種。對(duì)于發(fā)酵后的菠蘿皮飼料蛋白，應(yīng)以水洗去除含氮化合物后測(cè)得的粗蛋白質(zhì)含量比直接測(cè)得的粗蛋白質(zhì)含量作為標(biāo)準(zhǔn)比較合理。因?yàn)樗慈ヤ@態(tài)氮等含氮化合物后再檢測(cè)蛋白質(zhì)，雖會(huì)同時(shí)洗去部分氨基酸和水溶性蛋白，但所得結(jié)果能較客觀地反映出發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量，有效地避免培養(yǎng)基中微生物未利用的含氮化合物對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響。對(duì)表1中的單一菌種發(fā)酵后的產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量進(jìn)行比較，發(fā)酵產(chǎn)物水洗后蛋白質(zhì)含量較高的5株菌種依次為：黑曲霉，綠色木霉2，白地霉，菠蘿皮篩選酵母，產(chǎn)朊假絲酵母。由于菠蘿皮篩選酵母發(fā)酵所得的產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量無明顯優(yōu)勢(shì)，菌種還未經(jīng)鑒定，所以該菌種暫時(shí)不予以采用，而選用其他四種菌作為混菌發(fā)酵的出發(fā)菌種。

表1 單一菌種發(fā)酵后產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量 %

2.2 霉菌纖維素酶活力的測(cè)定 菠蘿皮含有相當(dāng)數(shù)量的纖維素，霉菌能分泌纖維素酶來分解纖維素使之轉(zhuǎn)化為各種糖類物質(zhì)，供給酵母合成蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。所以測(cè)定霉菌纖維素酶活力能夠更好地確定菌種分解纖維素的能力。為此，對(duì)本研究所采用的6株霉菌按照NY/T 912-2004和劉德海（2002）的方法進(jìn)行羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定，以保證所選的霉菌具有強(qiáng)的纖維素分解能力。纖維素酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，6株霉菌纖維素酶活力的測(cè)定見表2。

由表2可知，6株霉菌中綠色木霉2和黑曲霉比其他菌有非常明顯的羧甲基纖維素酶活力，這與表1的結(jié)果是相吻合的。也就是纖維素酶活力強(qiáng)的霉菌，其發(fā)酵后產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量也高。

2.3 混合菌種篩選試驗(yàn) 將單菌發(fā)酵試驗(yàn)中選出的4株發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量較高的菌株，即綠色木霉2、黑曲霉、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)過不同雙菌種組合按1∶1的比例進(jìn)行混合發(fā)酵試驗(yàn)，其組合方式和發(fā)酵結(jié)果見表3。

圖1 纖維素酶活力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 纖維素酶活力

從表3可看出，霉菌與酵母菌組合雙菌發(fā)酵產(chǎn)物的水洗蛋白含量明顯高于對(duì)照組的單菌發(fā)酵，這個(gè)結(jié)果也與郭維烈等（2002）報(bào)道的霉菌與酵母菌組合發(fā)酵可以提高菌體蛋白飼料的生產(chǎn)效率相吻合。其中，產(chǎn)朊假絲酵母和綠色木霉這個(gè)組合的發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量比較高。可以初步認(rèn)為是理想的發(fā)酵菌種組合。

表3 混合菌種組合方式和發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量 %

為進(jìn)一步判斷各種菌種不同組合的發(fā)酵效果，通過觀察各菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況來考察發(fā)酵產(chǎn)物的外觀，結(jié)果見表4。

在培養(yǎng)24 h后，白地霉+綠色木霉2和產(chǎn)朊假絲酵母+黑曲霉組合有白色少量菌絲，白地霉+綠色木霉2和產(chǎn)朊假絲酵母+綠色木霉2組合則沒有變化，48 h后白地霉+黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母+黑曲霉布滿白色菌絲，白地霉+綠色木霉2和產(chǎn)朊假絲酵母+綠色木霉2也有部分白色菌絲出現(xiàn)，在培養(yǎng)108 h之后，產(chǎn)朊假絲酵母+綠色木霉2組合培養(yǎng)基布滿了白綠色菌體且色澤均勻，白地霉+綠色木霉2組合培養(yǎng)基也分布了少量白色菌體但色澤不均勻，白地霉+黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母+黑曲霉組合培養(yǎng)基因被黑色菌體覆蓋而略呈黑色。

表4 混合菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況

烘干粉碎后產(chǎn)朊假絲酵母+綠色木霉2組合的發(fā)酵產(chǎn)物有氣味芳香，白地霉+綠色木霉2還有原菠蘿皮味，白地霉+黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母+黑曲霉組合雖氣味芳香但嗆鼻且顏色太黑。

綜合前面所述的發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量和各菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況及烘干粉碎后的感官評(píng)價(jià)，可以認(rèn)為產(chǎn)朊假絲酵母+綠色木霉2是最佳菌種組合。

2.4 最佳菌種組合接種比例的確定 為研究最佳菌種組合的使用比例，用上述試驗(yàn)所選出的菌種組合，將產(chǎn)朊假絲酵母和綠色木霉2分別按1∶5（0.2）、1∶2（0.5）、1∶1（1.0）、3∶2（1.5）、2∶1（2.0）、3∶1（3.0）、5∶1（5.0）、7∶1（7.0）的接種比例以5%的接種量接種后進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖2。

圖2 不同接種比例對(duì)產(chǎn)物蛋白含量的影響

由圖2可以看出，在產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉2接種比例小于 3∶2（1.5）時(shí)，粗蛋白質(zhì)和水洗蛋白的含量隨著兩者比例的增大而升高，但當(dāng)兩者接種比例大于1.5即大于3∶2后，粗蛋白質(zhì)和水洗蛋白的含量逐漸下降，由此可以認(rèn)為：產(chǎn)朊假絲酵母對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的影響較綠色木霉的影響大。原因是酵母利用了發(fā)酵原料中較多的糖分和無機(jī)鹽后在短時(shí)間內(nèi)合成了蛋白質(zhì)。但在發(fā)酵過程中，木霉的作用也是必不可少的，因?yàn)樗煞置诖罅康睦w維素酶，使菠蘿皮中的纖維素分解后轉(zhuǎn)化成糖類物質(zhì)，為酵母的生長繁殖提供必要的碳源和能量，并為蛋白質(zhì)的合成提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)；從感官狀態(tài)看，在不同菌種比例的發(fā)酵產(chǎn)物中，產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉2的接種比例為3∶2時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物具有濃郁的香味，色澤淡黃。但當(dāng)綠色木霉2接種比例增大時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物有明顯的霉味，色澤會(huì)變綠。因此，產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉以3∶2的比例進(jìn)行組合，發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量及感官評(píng)價(jià)最好。

2.5 混合菌種最佳接種量的確定 將產(chǎn)朊假絲酵母C+綠色木霉L以3∶2的比例分別按2%、5%、10%、15%、20%的總接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其蛋白質(zhì)含量見圖3。

圖3 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的影響

由圖3可知，在接種量小于5%時(shí)，隨著接種量的增多，粗蛋白質(zhì)和水洗蛋白含量逐漸增加，當(dāng)接種量超過5%以后，兩種蛋白質(zhì)含量都不再增加，曲線在平緩中略有下降。所以，最佳接種量為5%。

2.6 菠蘿皮發(fā)酵前后的蛋白含量及感官評(píng)價(jià)見表5。

從表5可看出，經(jīng)過產(chǎn)朊假絲酵母和綠色木霉2混合發(fā)酵后的菠蘿皮發(fā)酵產(chǎn)物，粗蛋白含量提高了，為24.71%，水洗粗蛋白含量也達(dá)到了16.96%，產(chǎn)品具有濃郁的酵母甜香味。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)（QB/T 1940-1994），動(dòng)物飼料蛋白要求粗蛋白質(zhì)含量大于20%，因此，本研究所得的菠蘿皮發(fā)酵產(chǎn)物適于做動(dòng)物蛋白飼料。

表5 菠蘿皮發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)含量及感官評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

以菠蘿皮為原料，經(jīng)烘干粉碎后添加麩皮20%、（NH）2SO43%、尿素 2%，KH2PO41%作為培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白，產(chǎn)朊假絲酵母和綠色木霉是理想的發(fā)酵菌種，將兩者以3∶2的比例、總接種量為5%等條件進(jìn)行發(fā)酵后，菠蘿皮干粉中的粗蛋白質(zhì)含量從原來的4.98%提高到24.71%，水洗去含氮物質(zhì)后粗蛋白質(zhì)含量提高到16.96%。達(dá)到了國家動(dòng)物飼料蛋白含量的要求。菠蘿皮發(fā)酵后所得的飼料產(chǎn)品氣味芳香，適口性好。

[1]GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.

[2]NY/T912-2004.飼料添加劑.纖維素酶活力的測(cè)定[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[3]QB/T1940-1994.飼料酵母[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.

[4]大連輕工業(yè)學(xué)院，華南理工大學(xué).食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1994.

[5]郭維烈，郭慶華，謝小寶，等.4320菌體蛋白飼料中雙菌作用機(jī)制的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2002，18（1）：122 ～125.

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[7]Sanchaisurinya P，Thammabut B.Effect of pineapple waste in growing-finishing pig diets[J].Kaen-Kaset Agriculture Journal，1994，22（4）：193 ～197.