黃 萍，馬朝宏，顏 謙

（1.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技開發(fā)處，貴州 貴陽 550006）

馬鈴薯莖尖培養(yǎng)又叫分生組織培養(yǎng)，是包括馬鈴薯在內(nèi)的許多植物脫除病毒的重要手段。自1955年，法國人Moral和Martin通過莖尖培養(yǎng)，獲得了無PVX、PVA和PVY的馬鈴薯植株后，這項(xiàng)技術(shù)快速發(fā)展，為解決馬鈴薯病毒危害提供了有效途徑。

但是在馬鈴薯莖尖組織培養(yǎng)過程中，因品種差異，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)莖尖在誘導(dǎo)過程中黃化苗發(fā)生嚴(yán)重的現(xiàn)象，影響了莖尖培養(yǎng)試管苗的構(gòu)建。關(guān)于如何控制馬鈴薯莖尖誘導(dǎo)過程中黃化苗的發(fā)生還未見詳細(xì)報(bào)道。本項(xiàng)目組多年來從事馬鈴薯的莖尖剝離培養(yǎng)工作，并開展了莖尖培養(yǎng)黃化苗發(fā)生的相關(guān)研究，以下是這一研究結(jié)果的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材是貴州省馬鈴薯研究所選育的馬鈴薯新品種B01-31-9。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯幼芽的獲取

在田間篩選無病蟲害感染、無損傷、健壯的薯塊用于室內(nèi)自然催芽，待芽長至2～5 cm時(shí)，切下幼芽。

1.2.2 消毒

將幼芽上的幼葉剝?nèi)?，?0%酒精滅菌30 s、再用10%次氯酸鈉溶液浸泡10～15 min后，無菌水清洗3～5次，備用。

1.2.3 莖尖剝離

將清洗干凈的幼芽置于40倍雙目解剖鏡下，用解剖針去掉未展開幼葉，直至露出半圓形光滑生長點(diǎn)，用解剖刀從0.3mm處切下，將切下的莖尖接種在裝有莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的試管或三角瓶內(nèi)，每管接1個(gè)剝離后的莖尖（三角瓶內(nèi)接4個(gè)），放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為2000lx，22℃，光照12h）。

1.2.4 莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基類型

以MS作為馬鈴薯莖尖誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中的大量元素（NH4NO3、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O及鐵鹽）作單因素試驗(yàn)（表1），其它因素仍為MS培養(yǎng)基中的使用濃度。外源激素濃度均為0.5 mg·L－16-BA和0.1 mg·L－1NAA，培養(yǎng)基pH值為6.0。每種培養(yǎng)基接種20個(gè)莖尖，重復(fù)3次。

表1 各因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)(mg·L－1)Table 1 Experiment designs of inducing factors

1.2.5 方差分析

對各因素處理下莖尖培養(yǎng)過程中黃化率及成苗率情況用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行新復(fù)極方差（SSR）分析，多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NH4NO3濃度改變對黃化苗的影響

圖1 NH4NO3濃度改變對黃化苗數(shù)及成苗率的影響Figure 1 Influence of concentration of NH4NO3on the etiolation and differentiation

由圖1可見，NH4NO3濃度大于或小于1 600 mg·L－1時(shí)，莖尖培養(yǎng)出現(xiàn)黃化苗的數(shù)量均較高，其中以濃度為2 000 mg·L－1形成黃化苗的平均數(shù)最高，達(dá)到3.8株，高出最低值3.4。但不同濃度處理對莖尖分化成苗數(shù)的影響差異不顯著。方差分析結(jié)果證明：NH4NO3不同濃度間在黃化率上的差異達(dá)到顯著水平（F=4.16，F(xiàn)0.05=3.48，F(xiàn)0.01=5.99），在莖尖成苗系數(shù)上的差異沒有達(dá)到顯著水平（F= 0.47，F(xiàn)0.05=3.48，F(xiàn)0.01=5.99）。經(jīng)SSR的多重比較，NH4NO3濃度為1 600 mg·L－1與2 000 mg·L－1和1 800 mg·L－1的黃化率有顯著差異（1 600 mg·L－1與2 000 mg·L－1，P=0.0045；1 600 mg·L－1與1 800 mg·L－1，P=0.095）。

2.2 MgSO4·7H2O濃度改變對黃化苗的影響

由圖2可見，MgSO4·7H2O的濃度在600 mg·L－1時(shí)，莖尖培養(yǎng)出現(xiàn)黃化苗的比例最高；其次則是200 mg·L－1和500 mg·L－1；當(dāng)濃度是400 mg·L－1時(shí)黃化苗數(shù)最低。在所試濃度范圍內(nèi)，400 mg·L－1最利于莖尖分化成苗，此時(shí)成苗率最高，是43%；當(dāng)?shù)陀?00 mg·L－1時(shí)，莖尖培養(yǎng)成苗率最低，為37%。

據(jù)方差分析表明，各濃度處理間在對馬鈴薯莖尖培養(yǎng)黃化苗發(fā)生的影響上達(dá)到了顯著水平（F=5.42，F(xiàn)0.05=3.48，F(xiàn)0.01=5.99），而對莖尖分化成苗的影響差異未達(dá)到顯著水平（F=0.59，F(xiàn)0.05= 3.48，F(xiàn)0.01=5.99）。由多重比較可知，400 mg·L－1與600 mg·L－1濃度雖對成苗率的影響差異不顯著，但對黃化苗數(shù)的影響差異達(dá)到了極顯著水平，此時(shí)P=0.0021。

圖2 MgSO4·7H2O濃度改變對黃化苗數(shù)及成苗率的影響Figure 2 Influence of concentration of MgSO4·7H2O on etiolation and differentiation

2.3 鐵鹽濃度改變對黃化苗的影響

從圖3可知，隨著鐵鹽濃度的增加，黃花苗的發(fā)生降低，降低的幅度達(dá)3.4株。經(jīng)方差分析，不同濃度處理和黃化苗發(fā)生的F值是20.3，遠(yuǎn)大于F0.05=4.07（F=20.3，F(xiàn)0.05=4.07，F(xiàn)0.01=7.59），表明鐵鹽的不同濃度處理間在黃化苗的發(fā)生上的差異達(dá)到了顯著水平。各濃度處理下莖尖培養(yǎng)成苗的比例以13.9 mg·L－1和83.4 mg·L－1處理下最高（是42%），高出最低值5%，但經(jīng)方差分析，各濃度處理對莖尖培養(yǎng)成苗影響的差異并不顯著，F(xiàn)值是0.062，小于 4.07（F=0.062，F(xiàn)0.05=4.07，F(xiàn)0.01=7.59）。

在以上4種處理濃度中，當(dāng)MS培養(yǎng)基中鐵鹽濃度只有13.9 mg·L－1（1/2倍）時(shí)，發(fā)生黃化苗的比例最高，與其它3個(gè)處理濃度達(dá)到了極顯著差異（1/2倍與1倍，P=0.0011；1/2倍與2倍，P=0.0003＜0.001；1/2與 3倍，P=0.0002＜0.001）。

圖3 鐵鹽濃度改變對黃化苗數(shù)及成苗率的影響Figure 3 Influence of concentration of iron salt on the etiolation and differentiation

圖4 CaCl2·2H2O濃度改變對黃化苗數(shù)及成苗率的影響Figure 4 Influence of concentration of CaCI2·2H2O on the etiolation and differentiation

2.4 CaCl2·2H2O濃度改變對黃化苗的影響

在所試CaCl2·2H2O的各濃度處理中，低于或高于400 mg·L－1的濃度范圍內(nèi)黃化苗出現(xiàn)的比例均高出400 mg·L－1的，其中以600 mg·L－1的濃度下黃化苗的發(fā)生率最高；在200 mg·L－1至400 mg·L－1的濃度范圍內(nèi)，隨CaCl2·2H2O濃度的增加，成苗率有增高的趨勢，以后CaCl2·2H2O濃度再增加對成苗率的變化影響不大（圖4）。據(jù)方差分析，CaCl2·2 H2O的各濃度處理對莖尖培養(yǎng)過程中黃化苗發(fā)生的均方比 F值是 2（F0.05=3.48，F(xiàn)0.01=5.99，P= 0.171），各濃度處理對莖尖培養(yǎng)成苗率的均方比值F=0.64（F0.05=3.48，F(xiàn)0.01=5.99，P=0.65），表明各處理因子對黃化苗發(fā)生及成苗率的影響均未達(dá)到顯著水平，即本試驗(yàn)所設(shè)的各處理濃度對黃化苗的發(fā)生及分化的影響不大。

3 討論

馬鈴薯莖尖組織培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)苗黃化現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)白化、甚至死苗，極不利于試管苗的構(gòu)建和增殖。為緩解莖尖培養(yǎng)過程中黃化苗的發(fā)生，本試驗(yàn)設(shè)置了4種因子的不同濃度處理研究，結(jié)果證明：鈣濃度對馬鈴薯莖尖培養(yǎng)過程中黃化苗的發(fā)生及成苗率的改變無顯著影響；鎂、氮和鐵鹽的濃度改變雖對莖尖成苗影響不明顯但對莖尖培養(yǎng)過程中黃化苗的發(fā)生有顯著的抑制作用；當(dāng)鎂和氮的使用濃度過高和過低時(shí)都會(huì)導(dǎo)致較高的黃化率發(fā)生，適當(dāng)?shù)氖褂脻舛饶苊黠@地降低黃化率，此濃度范圍與MS培養(yǎng)基中的接近；同時(shí)也證明高濃度的鐵鹽顯著降低了黃化苗的發(fā)生機(jī)率，其中以3倍于MS培養(yǎng)基中的鐵鹽濃度的效果最佳，降幅達(dá)16%。

關(guān)于植物黃化苗研究的大田試驗(yàn)報(bào)道較多[1-2]，主要原因是土壤營養(yǎng)元素（如氮、磷、鉀等）的缺乏引起。武建林等[3]報(bào)道了土壤氮、磷、鉀養(yǎng)分狀況對植物缺鐵黃化發(fā)生的重要影響，認(rèn)為硝態(tài)氮的吸收和還原所產(chǎn)生或釋放的氫氧根離子可引起植物體外pH升高，使鐵的有效性降低，從而導(dǎo)致黃化[4]。萬惠恩[5]在對黃瓜葉片黃化發(fā)生的研究中也提出，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)氮、磷、鉀濃度對于植物正常生長有明顯促進(jìn)作用，缺氮和氮過剩都會(huì)引起葉片黃化。以上報(bào)道的部分結(jié)論在我們的試驗(yàn)中得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證，證明在馬鈴薯莖尖培養(yǎng)過程中，增加鐵鹽濃度可明顯降低黃化苗的發(fā)生，缺氮、鎂和氮、鎂過剩都會(huì)提高黃化率。但前面報(bào)道的有些結(jié)論，如大田試驗(yàn)中pH、磷、鉀等因子也會(huì)引起植株黃化苗的發(fā)生，這是否適用于馬鈴薯的莖尖組織培養(yǎng)過程及最佳的使用濃度情況如何，還有待于以后的試驗(yàn)研究得出結(jié)論。

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