李春平，賴成霞，徐海江，張建國，瑪依拉·玉素音，張大偉，魏 鑫，劉忠山

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091，2.新疆海南良種繁育基地，烏魯木齊 830006)

0 引 言

【研究意義】離體胚培養(yǎng)是將分離的胚在人工培養(yǎng)的條件下，直接誘導(dǎo)發(fā)育成苗。該項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于遠(yuǎn)緣雜交獲得稀有雜種，單倍體的誘導(dǎo)，種子活力快速測定，特殊植物快速繁育等方面[1-5]。離體胚培養(yǎng)可以有效縮短作物育種時(shí)間，在棉花育種中有重要的應(yīng)用潛力。離體胚培養(yǎng)省去種子成熟，休眠和萌發(fā)所需要的時(shí)間，可以加快作物世代繁殖，縮短作物育種時(shí)間，對(duì)品種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在培養(yǎng)基和胚齡對(duì)離體胚的成苗率研究方面，Borole等[6]利用添加不同濃度的生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素的BT培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基對(duì)(亞洲棉×陸地棉)F1雜交胚，胚齡為12、15、20、25DPA(days after pollination)的幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)20DPA成苗效果最好，BT培養(yǎng)基成苗要優(yōu)于MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中添加1.5 mg/L IAA，0.5 mg/L KIN和250 mg/L CH的處理只一株成苗，其它MS培養(yǎng)基處理組合均未成苗。葉春燕等[7]比較了不同的培養(yǎng)基、激素和胚齡等對(duì)棉花胚珠表皮纖維發(fā)育的影響，認(rèn)為BT培養(yǎng)基較適合陸地棉胚珠的離體培養(yǎng)。徐莉等[8]篩選出適宜牡丹“鳳丹”的培養(yǎng)基，“鳳丹”的成苗率63.88%，成活率66.34%。徐陽等[9]研究了不同因素對(duì)甜柿幼胚的影響，影響大小依次為培養(yǎng)基、胚鈴、柿品種、培養(yǎng)條件。幼胚胚齡增大，胚成苗率逐漸提高。離體胚成苗培養(yǎng)不僅受到培養(yǎng)基和胚齡的影響，也受到溫度、光照的影響[10]。關(guān)麗霞等[11]研究了不同因素對(duì)后熟矮紫杉種子體胚萌發(fā)的影響，在白天溫度23℃(10 h)、夜間溫度13℃(14 h)的培養(yǎng)條件下，矮紫杉體胚萌發(fā)率可達(dá)94.44%。李麗等[12]研究了不同溫度、光照時(shí)間和激素組合對(duì)伊貝母種胚誘導(dǎo)及植株再生的影響，發(fā)現(xiàn)溫度為20℃，光照時(shí)間(12 h)為伊貝母種胚誘導(dǎo)最適宜條件，誘導(dǎo)率可達(dá)72.2%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國內(nèi)外對(duì)不同植物離體胚培養(yǎng)方面開展了大量的研究，該技術(shù)在加快世代繁殖，縮短育種時(shí)間等方面具有廣泛應(yīng)用價(jià)值[13]，但在早熟陸地棉方面研究相對(duì)較少。以往研究主要是基于無菌培養(yǎng)環(huán)境和成分復(fù)雜的培養(yǎng)基條件下開展的，由于培養(yǎng)基成分復(fù)雜、配制繁瑣且對(duì)試驗(yàn)環(huán)境要求較高，限制了該技術(shù)在生產(chǎn)中的大規(guī)模的應(yīng)用。在有菌水培條件下，建立一種操作簡便、適宜大規(guī)模應(yīng)用的棉花離體胚成苗技術(shù)。研究培養(yǎng)基、胚齡、溫度和光照時(shí)間對(duì)棉花胚成苗的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】選用早熟棉新品系作為研究材料，研究不同因素對(duì)離體胚的成苗率、成苗時(shí)間、根系性狀的影響及有菌、無菌培養(yǎng)污染發(fā)生特點(diǎn)。在菌水培條件下，分析早熟陸地棉離體胚成苗培養(yǎng)最適宜的胚齡、溫度和光照時(shí)間條件，為大規(guī)模開展以離體胚成苗技術(shù)為核心的棉花1年多代研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以早熟陸地棉新品系M319為試驗(yàn)材料，生育期120 d。2018～2019年，試驗(yàn)材料在瑪納斯縣六戶地鎮(zhèn)試驗(yàn)田內(nèi)種植。棉花離體胚培養(yǎng)分別在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯育種基地和新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2 方 法

1.2.1 取 樣

棉花第2、3果枝開花當(dāng)日進(jìn)行掛牌并登記開花日期，當(dāng)胚齡達(dá)到15、20、25、30和35 d分別摘取棉鈴進(jìn)行離體胚的培養(yǎng)。

1.2.2 接 種1.2.2.1 MS培養(yǎng)接種(無菌培養(yǎng))

棉鈴先用自來水清洗表面，然后用吸水紙去除表面水分。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用75%乙醇浸泡30 s，2次，用無菌水沖洗5～7次，15%H2O2消毒5 min，用無菌水沖洗3～4次，用無菌濾紙吸取表面水分，用滅菌解剖刀和鑷子將胚取出，接種MS培養(yǎng)基上每瓶接種10粒，每個(gè)處理6瓶。

1.2.2.2 蒸餾水、普通水(自來水)培養(yǎng)接種(有菌培養(yǎng))

操作為有菌操作，使用發(fā)芽盒、解剖刀等均不需要滅菌。棉鈴表面先用清水洗去表面灰塵，然后用吸水紙去除表面水分，用刀片將棉鈴切開，取出棉花胚用于培養(yǎng)。

離體胚培養(yǎng)的懸浮支撐物：選取5 mm左右厚度泡沫板，長寬可以根據(jù)發(fā)芽盒的大小確定；用打孔器在泡沫板上打孔，孔徑直徑大小根據(jù)胚的具體大小確定，以棉花胚根萌發(fā)部位接觸水的表面，以不落入水為準(zhǔn)，每個(gè)泡沫板打20個(gè)孔。

將自來水、蒸餾水倒入約發(fā)芽盒體積2/3位置即可，放入懸浮物，將棉花離體胚放入懸浮泡沫板孔洞內(nèi)，用透明保鮮膜進(jìn)行密封處理，然后放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2.3.1 不同培養(yǎng)基和胚齡條件下的離體胚成苗培養(yǎng)

采用雙因素設(shè)計(jì)。其中培養(yǎng)基為3種：MS、普通水(自來水)、蒸餾水，其中MS為對(duì)照(CK)；胚齡胚為5水平：15、20、25、30和35 d，共計(jì)15個(gè)處理。MS培養(yǎng)每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，蒸餾水和普通水培每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。

光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件：溫度為28℃，光照時(shí)間為22 h，光照強(qiáng)度為12 000 lx。MS為無菌培養(yǎng)，蒸餾水和普通水為有菌培養(yǎng)。

1.2.3.2 光照時(shí)間、溫度的離體胚培養(yǎng)

研究溫度、光照時(shí)間對(duì)胚成苗的影響，試驗(yàn)采用雙因素3水平設(shè)計(jì)，其中溫度為28、30和32℃，光照時(shí)間為12、22和24 h，共計(jì)9個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。按照最佳胚齡的胚為試驗(yàn)對(duì)象，普通水為培養(yǎng)基，光照強(qiáng)度12 000 lx培養(yǎng)條件，將裝有離體胚的發(fā)芽盒放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。表1

表1 不同溫度、光照時(shí)間處理

1.2.4 測定指標(biāo)

成苗：離體胚的子葉90%面積變綠色即為成苗。

成苗時(shí)間：將裝有離體胚三角瓶和發(fā)芽盒放入培養(yǎng)箱內(nèi)開始到成苗的時(shí)間。

根系長度：從白色下胚軸開始測量根的長度。

根數(shù)：計(jì)量長度大于0.5 cm根的數(shù)量。

成苗污染率=污染株數(shù)/總株數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2007、Spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體胚的成苗污染

研究表明，有菌與無菌培養(yǎng)的菌類發(fā)生和生長的規(guī)律不同。普通水、蒸餾水培養(yǎng)屬于有菌培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中離體胚死亡后菌類在其表面迅速大量繁殖，部分有損傷的成苗在其損失部位出現(xiàn)菌類大量繁殖的現(xiàn)象，并且水中出現(xiàn)少量的藻類，但是對(duì)成苗影響較小。水培條件下，20、25、30和35 d胚的平均成苗污染率分別為15.8%、5.0%、2.8%和0.6%。在離體胚的成苗期內(nèi)，污染胚或成苗表面菌類大量繁殖，不會(huì)影響其它正常胚或成苗的生長和發(fā)育。CK培養(yǎng)屬于無菌培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶內(nèi)污染速度快，4～5 d培養(yǎng)基和胚上全部長菌，嚴(yán)重影響胚的生長發(fā)育，最終導(dǎo)致胚或苗的死亡。

2.2 不同培養(yǎng)基條件下，胚成苗生長

研究表明，普通水、蒸餾水與CK培養(yǎng)條件下，相同胚齡的離體胚成苗后生長情況基本相同，不同胚齡之間生長差異較大。不同胚齡成苗具有以下特點(diǎn)：胚齡較小的胚成苗長勢弱，下胚軸和根纖細(xì)，根數(shù)較少，子葉小而薄，葉色淺綠。胚齡較大的成苗健壯長勢強(qiáng)，下胚軸和根系粗壯，子葉肥大顏色深綠。其中35 d胚成苗長勢最強(qiáng)，葉色深綠，胚軸和根粗壯，根數(shù)量多。圖1

圖1 普通水培養(yǎng)成苗(從左到右依次為20 d、25 d、30 d、35 d胚)

2.3 不同培養(yǎng)基、胚齡對(duì)胚成苗率和成苗時(shí)間的影響

研究表明，不同培養(yǎng)基條件下，離體胚的成苗率之間差異達(dá)到顯著水平，其中普通水與蒸餾水成苗率之間差異不顯著，與CK成苗率達(dá)到顯著水平，大小依次為CK>普通水>蒸餾水。雖然水培與CK成苗率相比存在極顯著性差異，但是隨著胚齡的增加相同胚齡的離體胚的成苗率差異逐漸減小，當(dāng)胚齡為35 d時(shí)，3種培養(yǎng)基成苗率之間差異不顯著。在普通水培養(yǎng)條件下，20、25、30和35 d離體胚成苗率分別比對(duì)照低50%、36.3%、8.7%和1.3%；蒸餾水條件下，20、25、30和35 d離體胚成苗率分別比對(duì)照低51.3%、38.8%、10.0%和1.3%，其中15 d胚成苗率為0。當(dāng)胚齡大于30 d時(shí)，水培與CK的胚成苗率相差10%以下，且成苗率均在90%以上。水培可以用于胚齡大于30 d胚的成苗培養(yǎng)。

不同胚齡離體胚成苗率、成苗時(shí)間之間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。水培條件下，35 d離體胚的成苗率最高達(dá)到98.8%，與其它胚齡成苗率的差異均達(dá)到顯著水平，大小依次為35 d>30 d>25 d>20 d>15 d。不同胚齡的離體胚成苗率呈現(xiàn)隨著胚齡的增加而增加的趨勢。不同胚齡胚的成苗時(shí)間之間差異達(dá)到顯著水平，成苗時(shí)間隨著胚齡增加而減少，成苗時(shí)間大小依次為35 d<30 d<25 d<20 d，其中35 d成苗時(shí)間最短為11.1 d。水培養(yǎng)的離體胚的最佳胚齡為35 d。圖2

圖2 不同培養(yǎng)條件下胚的成苗率

2.4 不同培養(yǎng)基、胚齡對(duì)根長和根數(shù)的影響

研究表明，普通水與蒸餾水的成苗根長之間差異不顯著，與CK成苗根長差異顯著，其平均根長大小依次為CK>普通水>蒸餾水。不同胚齡胚的成苗根長之間差異達(dá)到顯著水平，并且成苗根的長度隨著胚齡增加而增加，其中胚齡35 d的成苗根最長。

胚齡是影響成苗根數(shù)的關(guān)鍵因素，影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。成苗的根數(shù)隨著胚齡的增加而增加，并且不同胚齡之間的成苗根數(shù)差異達(dá)到極顯著水平，根數(shù)大小35 d>30 d>25 d>20 d。表1，圖1

2.5 溫度、光照時(shí)間對(duì)胚的成苗率和成苗時(shí)間的影響

研究表明，不同溫度條件下，胚的成苗時(shí)間差異達(dá)到顯著水平，其中30與28、32℃條件下的成苗時(shí)間差異達(dá)到顯著水平，28與32℃條件下的成苗時(shí)間差異不顯著，成苗時(shí)間大小依次為30℃<28℃<32℃。30與28、32℃相比成苗時(shí)間分別縮短了0.8 和1.1 d。適宜的溫度可以縮短胚的成苗時(shí)間。

不同光照時(shí)間條件下，成苗時(shí)間之間差異達(dá)到顯著水平，大小依次24 h<22 h<12 h。光照時(shí)間越長，其成苗時(shí)間越短，其中光照時(shí)間24與12 h相比成苗時(shí)間縮短1.8 d，與22 h相比縮短了0.8 d，延長光照時(shí)間有利于縮短胚的成苗時(shí)間。

在不同處理中，T6成苗時(shí)間最短為9 d，與T3、T5成苗時(shí)間之間差異不顯著，與T1、T2、T4、T7、T8和T9成苗時(shí)間之間差異達(dá)到顯著水平。不同各處理成苗時(shí)間大小依次為T6

表2 不同溫度和光照時(shí)間下35 d離體胚成苗時(shí)間變化

2.6 不同因素及處理對(duì)成苗胚根系性狀的影響

2.6.1 不同因素及處理對(duì)成苗根長的影響

研究表明，在培養(yǎng)溫度30℃條件下，成苗的根長最長，與32℃條件下的成苗根長差異顯著，與28℃條件下的成苗根長差異不顯著，根長大小依次30℃>28℃>32℃。30℃是最適宜根長發(fā)育的溫度。

在培養(yǎng)光照時(shí)間12 h條件下，成苗的根長最長，與22、24 h條件下的成苗根長之間差異顯著，22與24 h條件下的成苗根長之間差異不顯著，根長大小依次為12 h>22 h>24 h。光照12 h是最適宜根長發(fā)育的光照時(shí)間。

T4處理的成苗根長最長，與其它處理成苗根長之間差異達(dá)到顯著水平，大小依次為T4>T1>T5>T7>T2>T6>T3>T8>T9。T4培養(yǎng)條件較其它處理更有利于根的伸長，其培養(yǎng)溫度為30℃，光照時(shí)間為12 h。表3

2.6.2 不同因素及處理對(duì)成苗根數(shù)的影響

研究表明，適宜的溫度有利于增加成苗的根數(shù)，其中30℃條件下成苗的根數(shù)最多，與28、32℃根數(shù)差異達(dá)到顯著水平，大小依次30℃>28℃>32℃。30℃時(shí)較其它溫度更有利于根數(shù)增加。

不同光照時(shí)間的成苗根數(shù)差異達(dá)到顯著水平，光照時(shí)間12 h條件下的成苗的根數(shù)最多，與22、24 h條件下的成苗根數(shù)之間差異顯著，22與24 h條件下的根數(shù)之間差異不顯著，根長大小依次為12 h>22 h>24 h。光照12 h與其它相比是根數(shù)的最佳光照時(shí)間。

T4處理的成苗根數(shù)最多，與其它處理成苗根數(shù)之間差異達(dá)到顯著水平，大小依次為T4>T5>T1>T6>T7>T2>T3>T8>T9。T4培養(yǎng)條件與其它處理相比，更有利于根數(shù)的增加，其培養(yǎng)溫度為30℃，光照時(shí)間為12 h。表3

表3 不同溫度和光照時(shí)間下35 d胚的成苗根發(fā)育變化

3 討 論

培養(yǎng)基和胚齡是離體胚成苗培養(yǎng)中的關(guān)鍵影響因素，對(duì)成苗率和成苗根系發(fā)育影響顯著。時(shí)香玉等[14,15]對(duì)個(gè)棉花種間雜交胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)雜種胚珠適宜培養(yǎng)時(shí)期是授粉后4～6 d，2 d的胚珠培養(yǎng)易產(chǎn)生愈傷組織，成胚率低，8 d后幼胚敗育或脫落。不同培養(yǎng)基胚珠培養(yǎng)獲得的胚和成熟胚的頻率不同，適宜雜種胚珠培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：BT基本培養(yǎng)基+NH4Cl 1 000 mg/L+IAA 1.5 mg/L+KT 0.2 mg/L+GA 0.06 mg/L。胚珠產(chǎn)生胚和胚的萌發(fā)頻率不僅與培養(yǎng)條件有關(guān)，與其雜交組合的親本的生理特性也有很大關(guān)系。耿興敏等[16]研究表明，杜鵑遠(yuǎn)緣雜交離體成苗培養(yǎng)中，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的胚成苗率存在差異，其中WPM(woody plant medium)培養(yǎng)基成苗率高于MS培養(yǎng)基，并且胚齡對(duì)雜交胚的萌發(fā)率及成苗途徑均有顯著影響。不同雜交組合最適宜拯救時(shí)間不同，幼胚容易形成愈傷組織，相對(duì)成熟胚容易形成苗。余小玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基早食李胚成苗率差異較大，花后88 d胚在WPM培養(yǎng)基的成苗率比MS培養(yǎng)基上高1倍左右；胚的成苗率隨著胚齡增加而升高，至果實(shí)成熟時(shí)成苗率可達(dá)26.0%。陳穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，不同銀杏品種成熟離體胚在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其成苗率、根長、苗高出現(xiàn)差異，不同培養(yǎng)基對(duì)成熟離體胚培養(yǎng)差異大于品種之間差異。王玉柱等[19]利用不同培養(yǎng)基對(duì)駱駝黃杏品種的不同胚齡進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基和胚齡胚的成苗率不同，其中6種培養(yǎng)基中Tukey培養(yǎng)基為佳，胚成苗率隨著胚齡增加而增加。

試驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基、胚齡是離體胚成苗的關(guān)鍵因素，不同培養(yǎng)基、胚齡的成苗率差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，不同胚齡的離體胚成苗時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)。雖然水培與MS培養(yǎng)的低齡胚成苗率差異顯著，但是隨著胚齡增加成苗率差異也逐漸減小。當(dāng)胚齡為35 d時(shí)，水培與MS的胚成苗率相差僅為1.2%。這種情況出現(xiàn)主要是MS培養(yǎng)基可以提供低齡胚成苗所需物質(zhì)，而普通水和蒸餾水則不能提供造成的。高齡胚由于子葉已經(jīng)積累較多營養(yǎng)物質(zhì)不需要從外界吸收大量的營養(yǎng)物質(zhì)即可發(fā)育成苗，所以水培與MS的胚成苗率相差較小。對(duì)于不同胚齡胚，胚成苗率隨著胚齡增加而逐漸增加，其成苗規(guī)律與前人研究結(jié)果一致。胚齡不僅對(duì)胚的成苗率產(chǎn)生影響，同時(shí)也對(duì)成苗時(shí)間、根長、根數(shù)產(chǎn)生影響。在不要求無菌苗情況下，水培法可以用于早熟陸地棉花胚齡為35 d胚的離體培養(yǎng)，其與MS培養(yǎng)相比是一種操作簡單、經(jīng)濟(jì)高效離體培養(yǎng)方法。

徐顯[20]研究發(fā)現(xiàn)，8月12日取胚齡為18、20、23和25 d胚培養(yǎng)均能成苗。8月19日所取的胚中只有23和25 d胚能夠成苗。該階段胚發(fā)育的平均溫度，≥20積溫均小于8月12日。胚齡確定幼胚作為離體培養(yǎng)指標(biāo)是不可靠。試驗(yàn)中，培養(yǎng)的離體胚為棉花第2、3果枝的棉鈴，并且35 d離體胚的成苗2年試驗(yàn)結(jié)果具有較好重復(fù)性，因此，早熟棉第2、3果枝棉鈴的胚齡可以作為離體培養(yǎng)的參考指標(biāo)。

溫度、光照時(shí)間是胚成苗及生長關(guān)鍵條件之一。張肖等[21]認(rèn)為光照雖然影響胚根的生長，抑制胚軸的伸長，但有利于子葉長度的增加和葉綠素的合成。低溫和高溫不利于胚根的伸長和子葉生長；黑暗條件下溫度顯著影響胚軸生長。楊菲等[22]研究發(fā)現(xiàn)在同樣培養(yǎng)條件下，光照下紅豆杉離體胚的萌發(fā)率略高于黑暗下的萌發(fā)率，光照更利于幼苗生長。

溫度、光照時(shí)間是離體胚成苗時(shí)間的關(guān)鍵因素，不同的溫度、光照時(shí)間離體胚成苗時(shí)間之間存在顯著性差異(P<0.05)。適宜溫度可以縮短離體胚成苗時(shí)間，有利于根長的生長和根數(shù)的增加。光照時(shí)間的延長有利于縮短胚成苗時(shí)間，但是不利于根系的伸長和根數(shù)的增加。

4 結(jié) 論

培養(yǎng)基、胚齡、溫度、光照時(shí)間是影響離體胚成苗的關(guān)鍵因素。水培與MS培養(yǎng)條件下，胚齡35 d胚成苗率差異不顯著；高胚齡、適宜溫度和光照時(shí)間有利于離體胚的成苗和促進(jìn)根系發(fā)育。在胚齡35 d、溫度30℃、光照時(shí)間24 h的培養(yǎng)條件下，離體胚的水培成苗效果好，可作為早熟陸地棉離體胚成苗簡化培養(yǎng)的適宜條件。