李婧

毛細管電泳芯片的臨床應用現(xiàn)狀

李婧

毛細管電泳；芯片；臨床應用

毛細管電泳芯片（microchip capillary electrophoresis）是在常規(guī)毛細管電泳（capillary electrophoresis,CE）的原理和技術(shù)基礎(chǔ)上，利用微加工技術(shù)在平方厘米級大小的芯片上加工出各種微細結(jié)構(gòu)，如通道和其它功能單元，通過不同的通道、反應器、檢測單元等的設(shè)計和布局，實現(xiàn)樣品的進樣、反應、分離和檢測，是一種多功能化的快速、高效和低耗的微型實驗裝置。該項技術(shù)可望發(fā)展成微全分析系統(tǒng)和芯片實驗室的主流技術(shù)。它的研究和廣泛應用，將使疾病診斷和治療、環(huán)境監(jiān)測、新藥研究開發(fā)、食品安全檢測等許多領(lǐng)域產(chǎn)生革命性變化，已成為當今化學、生命科學、微機械、物理、計算機、微電子技術(shù)等領(lǐng)域的重要研究課題之一。到目前為止，毛細管電泳芯片已用于糖類化合物的分離檢測、氨基酸對應體的拆分、蛋白質(zhì)和多肽分析、神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的分離檢測、寡核苷酸的分離、DNA測序和DNA限制性片段分離等分離分析研究。隨著應用實踐的增加，該項技術(shù)將成為臨床實驗室的有效分析工具。

1 腫瘤

已有利用毛細管電泳芯片方法分析腫瘤敏感性基因的報道，包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和等位基因特異性DNA擴增結(jié)合雜交雙鏈分析。BRCA1和BRCA2基因中常見突變與乳腺癌呈強相關(guān)性，尤其是在北歐猶太教人群中。利用毛細管電泳芯片，Tian等[1,2]將單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析時間降低到約130 s，比傳統(tǒng)方法至少提高了100倍。他們又將等位基因特異性DNA擴增與雜交雙鏈分析聯(lián)合，檢測BRCA1和BRCA2基因中每個突變。該系統(tǒng)也被用于分析T和B淋巴細胞增殖失調(diào)，結(jié)果表明毛細管電泳芯片提供與平板凝膠電泳和傳統(tǒng)毛細管電泳相同的信息，但是分析時間更短（毛細管電泳芯片為160 s，平板凝膠電泳為2.5 h，毛細管電泳為15 min）。Thomas等[3]在充滿各種分離基質(zhì)的微通道中進行毛細管電泳來快速分析基因組DNA中低豐度點突變的連接酶檢測產(chǎn)物。在來自結(jié)直腸腫瘤的DNA中檢測人k-ras癌基因中點突變，在不到120 s內(nèi)將連接酶檢測反應產(chǎn)物與未連接引物區(qū)分，比毛細管凝膠電泳快17倍，只是分辨率輕度降低。Cantafora等[4]用結(jié)合競爭和毛細管電泳芯片的逆轉(zhuǎn)錄PCR評價了參與人類腸道細胞脂類運輸?shù)男攀筊NA，結(jié)果顯示分析特定信使RNA能夠可靠評價CaCo-2細胞中相應基因的表達，并證明膽固醇作為特定因子如LXR-α和FXR正向誘導劑的作用。還可以在芯片上進行酶學分析來測定蛋白激酶。分析試劑通過電滲流被混合在雕刻的通道內(nèi)，用熒光素標記的七肽作為底物進行酶反應。底物和反應產(chǎn)物被電泳分離，結(jié)果證明毛細管電泳芯片對于無法獲得熒光底物而需要進行酶學分析十分有用[5]。

2 心血管相關(guān)疾病

現(xiàn)已證明毛細管電泳芯片可以作為分析LDL和同型半胱氨酸來評價動脈粥樣硬化的一種診斷工具[6,7]。而且，還可以通過分析細胞中DNA片段來評價個體心肌細胞的凋亡，從而診斷阿霉素誘導的心肌病，后者化療患者的一種危及生命的狀態(tài)?；诿毠茈娪拘酒碾娀瘜W檢測已被用于分析總同型半胱氨酸和結(jié)合蛋白的同型半胱氨酸，該技術(shù)可以用于有心血管病風險患者的常規(guī)檢測。Kleparnik等[8]在芯片中用CD樣微液體設(shè)備進行細胞裂解、電泳和激光誘導熒光測定阿霉素誘導的個體心肌細胞凋亡。通過分析阿霉素處理不同時間的細胞中DNA片段檢測凋亡。結(jié)果顯示心肌細胞暴露阿霉素的時間延長與細胞壞死相關(guān)。

3 腎臟標志物

分析生物體液中的肌酐、肌酸、尿酸、尿素和對氨基馬尿酸能夠評價腎臟和肌肉功能?，F(xiàn)人們已經(jīng)將芯片分析腎臟標志物與電化學檢測聯(lián)合應用。一種方法是將使用肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的酶學生物分析和電泳分離與電流計測定相偶聯(lián)。金覆蓋的厚膜電極用于電流計檢測，檢測限為2×10-5～4×10-5mol/L（信噪比為3）[9]。另一種方法是通過脈沖電流測定含氮化合物和更易氧化的尿酸來直接測定腎臟標志物。四種腎臟標志物在5 min內(nèi)輕松測定。在不到2 min內(nèi)即可測定肌酐/肌酸比值，而傳統(tǒng)肌酐分析方法需要約20 min[10]。可見毛細管電泳芯片能夠快速、簡便、經(jīng)濟的測定腎功能，對于零散的臨床檢測和床邊檢測具有潛在的優(yōu)點。

4 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

毛細管電泳芯片已經(jīng)被用于分析腦脊液（CSF）標本測定炎性細胞因子和神經(jīng)功能酶的抑制劑。Lapos等[11]利用毛細管電泳芯片設(shè)備結(jié)合雙激光誘導熒光（LIF）和電化學檢測裝置分析多發(fā)性硬化患者腦脊液標本?；谛酒拿庖呶椒蛛x還可以與毛細管電泳結(jié)合用于快速分析腦脊液中炎性細胞因子。一組6個固定抗體被粘附在芯片的注射孔中來分離創(chuàng)傷性腦損傷患者腦脊液中反應性細胞因子[12]。

5 甲狀腺功能

Schmalzing等[13]描述了一種競爭性免疫分析方法測定血清甲狀腺素，原理是在融合的硅芯片中進行電泳分離和LIF檢測。分析速度比傳統(tǒng)的免疫分析和毛細管電泳顯著加快，在約15 min內(nèi)分離血清中未標記的甲狀腺素。另外，一種使用二茂絡(luò)鐵氧化還原標記的基于芯片的電流計競爭性免疫分析已被用于測定三碘甲腺原氨酸。該分析由芯片、標記抗原和靶抗原與抗體的柱前反應、游離和結(jié)合的標記抗原的電泳分離和電流計檢測氧化還原標簽組成。最小檢測濃度是1000 μg/L，分析時間130 s[14]。雖然上述方法是用于測定甲狀腺功能，但是將免疫反應、電泳分離和靈敏的檢測系統(tǒng)整合在芯片平臺上能快速進行更多分析物的免疫分析。

6 感染性疾病/病原體

由于某些感染性疾病的急性本質(zhì)以及日益增加的恐怖威脅，高速高效的毛細管電泳芯片可能成為測定病原體和診斷感染性疾病的有力工具。現(xiàn)可以用毛細管電泳芯片檢測樣本中病毒和細菌的存在。目前多數(shù)研究集中于分析提取的和PCR擴增的核酸片段而非完整的病毒或細菌顆粒。

6.1 病毒感染Zhou等[15]開發(fā)了一種微液體系統(tǒng)測定嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒。與傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄PCR相比，該系統(tǒng)對于臨床診斷嚴重急性呼吸綜合征患者的咽拭子具有更高陽性率（17/18對12/18，陽性鑒定），且更快速。Chen等[16]定性和定量分析了丙型肝炎病毒。對于定性分析，他們用塑料芯片分析了利用2對擴增5’非編碼區(qū)的引物產(chǎn)生的2步PCR產(chǎn)物。毛細管電泳芯片裝置能在不到1.5 min內(nèi)分辨丙型肝炎病毒的145 bp擴增子。定量分析運用了逆轉(zhuǎn)錄競爭性PCR。從血清中提取的野生型RNA與已知量的具有相同引物結(jié)合區(qū)域（刪除了靶RNA特定中心位點的25 bp片段）的重組內(nèi)標準RNA共同逆轉(zhuǎn)錄和共同擴增。該結(jié)果與商品化雜交分析結(jié)果相當，但降低了工作強度。通過分析CSF中提取DNA的PCR產(chǎn)物能進行單純皰疹病毒診斷。Hofgartner等[17]用毛細管電泳芯片分析33個CSF樣本中的已知DNA進行單純皰疹病毒PCR檢測。與已經(jīng)建立的方法相比，毛細管電泳芯片達到100%靈敏度和特異性的分析時間更短。因為省略了雜交步驟，實時定量熒光PCR也具有快速分析的優(yōu)點，但是需要昂貴的設(shè)備。相反，毛細管電泳芯片技術(shù)則具有多方面優(yōu)點，它能檢測各種熒光標記的臨床標志物，而且除分離和檢測步驟以外還加入了其他實驗功能。Vegvari等[18]發(fā)展了一種雜交微設(shè)備，用聚氯乙烯載板和融合成U型溝的硅芯片來分析各種標本，包括肽、蛋白、DNA、病毒和細菌。因為融合硅毛細管具有高透光性，適用于紫外線檢測，所以人們期待該設(shè)備能得到廣泛應用。

6.2 細菌感染將PCR和CE整合的芯片設(shè)備已經(jīng)被用于分析細菌，如大腸桿菌、葡萄球菌、沙門菌和鏈球菌。Lagally等[19]研發(fā)了一種集成化便攜式基因分析系統(tǒng)檢測病原體。該系統(tǒng)可以同時檢測被檢細胞群的血清型和病原狀態(tài)以及抗生素抗性。也出現(xiàn)了其它集成細胞裂解、多重PCR擴增和帶有標志物的PCR產(chǎn)物的電泳分離的芯片設(shè)備。例如，整合了PCR、微液體泵和電泳的塑料微液體設(shè)備可以進行細菌檢測和鑒定，可以成功分析該設(shè)備PCR反應產(chǎn)生的大腸桿菌和沙門菌基因組DNA的擴增子[20]。

7 免疫失調(diào)

IgG與慢性感染（多克隆增加）或癌癥（單克隆增加）相關(guān)，現(xiàn)已出現(xiàn)了幾種毛細管電泳芯片方法檢測IgG濃度增加。Linder等[21]發(fā)展了一種非均質(zhì)競爭性免疫分析測定人IgG，用Cy5-人IgG作為示蹤物，Cy3-鼠IgG作為內(nèi)標準。定量血清中人IgG十分困難，因為IgG濃度低時SD相對高，濃度高時濃度依賴性又差。但是，區(qū)分IgG增加的患者血清標本（慢性感染患者中的35.5 g/L和骨髓瘤患者中的64.7 g/L）和那些IgG濃度在參考范圍內(nèi)的標本還是較容易的。帶有短毛細管的傳統(tǒng)CE和玻璃微芯片CE設(shè)備被用于分析異硫氰酸熒光素標記的抗人IgG。微芯片設(shè)備有幾個優(yōu)點，包括高效、快速、樣本和試劑用量少。Wang等[22]描述了一種在芯片平臺上進行的電化學酶免疫分析。堿性磷酸酶標記的抗體與抗原進行柱前反應，電泳分離游離抗體和抗體-抗原復合物，酶示蹤物和4-氨基苯磷酸底物的柱后反應，電流計檢測被釋放的4-苯酚等操作均在同一設(shè)備上進行。

8 糖尿病

胰島素和葡萄糖測定對于診斷糖尿病、胰島細胞失能、低血糖和胰島素瘤十分重要。幾項研究嘗試用毛細管電泳芯片測定胰島素和葡萄糖。Wang等[23]利用雙免疫和酶芯片分析同時測定胰島素和葡萄糖。胰島素免疫檢測使用堿性磷酸酶標記的抗體和柱后加入對硝基苯酚磷酸鹽底物，葡萄糖分析用葡萄糖脫氫酶和NAD+進行?，F(xiàn)已研制出基于連續(xù)電泳的免疫分析用于監(jiān)測活細胞激素分泌的微液體芯片。可以用CE競爭性免疫分析檢測胰島分泌的胰島素?？梢缘玫揭葝u素分泌譜，觀察到胰島素分泌的一期和二期特點。毛細管電泳芯片系統(tǒng)非常適合以高時間分辨率監(jiān)測活細胞的化學環(huán)境，該裝置可以用于常規(guī)臨床實驗室。

9 遺傳病

毛細管電泳芯片還可以分析遺傳病如進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良（DMD）和血色素沉著病，以及分析基因組DNA。DMD是由X染色體上的營養(yǎng)障礙基因的突變導致的。通過檢測該病攜帶者基因中重復或刪除的外顯子可以鑒定疾病。與DMD相關(guān)的刪除/重復傾向于定位在基因的某個區(qū)域，因此直接分析一定數(shù)目PCR擴增DNA片段即可進行診斷DMD。紅外線介導的PCR擴增與毛細管電泳芯片的DNA分離相偶合的集成微裝置就是為此目的而發(fā)展的。其原理是，紅外線輻射直接加熱PCR混合物但不加熱芯片，加快了溫度循環(huán)并縮短分析時間。但PCR循環(huán)期間芯片篩分基質(zhì)緩沖液影響了分離效率。因此在成功應用之前必須解決加熱與PCR整合在一起的問題。盡管如此，與傳統(tǒng)方法比較（如Southern blot），PCR-CE極大節(jié)省了時間、人力和材料，解決了加熱問題可能會使基于毛細管電泳芯片的診斷裝置用于遺傳病的診斷[24]。Ertl等[25]開發(fā)了一種鞘液流動支持的電化學檢測系統(tǒng)，用于毛細管電泳芯片分析等位基因特異的基于PCR的單核苷酸多態(tài)性分型，并通過檢測C282Y多態(tài)性證明該系統(tǒng)可以用于遺傳性血色素沉著病的診斷。鞘液流動設(shè)計最大限度減少了來自檢測系統(tǒng)電泳電位的干擾。與光學檢測系統(tǒng)不同，電化學檢測器更容易小型化，因為不需要龐大的光學元件（即光源、透鏡和濾光片）。多電極的應用使該系統(tǒng)成為便攜式微全分析系統(tǒng)，可以進行復雜混合物的分析。

綜上所述可見，傳統(tǒng)CE革新了DNA分析，在成功完成人類基因組計劃中發(fā)揮重要作用；毛細管電泳芯片技術(shù)則代表了小型化、快速、自動化和集成分析系統(tǒng)的另一個重要階段，可以更經(jīng)濟、更快速、更靈敏和更具有選擇性的解決復雜的臨床分析問題。與傳統(tǒng)CE相比毛細管電泳芯片存在一些缺點，如因為分離通道更短導致峰容量更低以及由于芯片焊接材料一般不能使紫外光透過導致無法兼容通用的紫外檢測器。但是快速、樣品制備和衍生步驟容易整合從而進一步減少分析時間和人力消耗是毛細管電泳芯片的重要優(yōu)點，而成本和速度則是現(xiàn)代臨床分析所關(guān)心的重要問題。

盡管目前毛細管電泳芯片仍處于發(fā)展的早期階段，但該技術(shù)已經(jīng)顯示在許多臨床分析領(lǐng)域的應用價值。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，基于毛細管電泳芯片的分子診斷方法被證明在分析速度、節(jié)約成本和檢測靈敏度方面具有顯著優(yōu)點。如上所述，已經(jīng)有相當多的基于毛細管電泳芯片的新應用。隨著高度自動化、高通量商業(yè)化設(shè)備的引入，毛細管電泳芯片可能取代常規(guī)分析中許多復雜和較慢的分析系統(tǒng)，成為臨床分析的重要設(shè)備。

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[2010-05-24收稿，2010-06-20修回]

[本文編輯：韓仲琪]

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